Samenvatting gen- en celtechnologie: les 4 basis celcultuur; cel assay’s

Inhoud
Cel viabiliteit/proliferatie ........................................................................................................................ 2
Celdeling – proliferatie – viabiliteit – cel stress – celdood .................................................................. 2
Toxiciteit en viabiliteit ......................................................................................................................... 2
Celproliferatie – viabiliteit ................................................................................................................... 3
Viabiliteits assay’s............................................................................................................................ 3
Celcyclus analyse ................................................................................................................................. 7
Viabiliteits assay’s............................................................................................................................ 7
Monitoring............................................................................................................................................... 9
Tijdspunt van analyse .......................................................................................................................... 9
Longitudinal/continue/real-time monitoring ................................................................................ 10
Celdood ................................................................................................................................................. 12
Types celdood.................................................................................................................................... 12
Apoptose vs necrose ..................................................................................................................... 12
Apoptose ....................................................................................................................................... 13
Necrose.......................................................................................................................................... 14
Andere ........................................................................................................................................... 14
Celdood detectie ............................................................................................................................... 15
Caspase activiteit ........................................................................................................................... 15
DNA fragmentatie.......................................................................................................................... 16
Membraanveranderingen ............................................................................................................. 16
Mitochondriale schade .................................................................................................................. 17
Senescentie ........................................................................................................................................... 18
Functionele assay’s................................................................................................................................ 19
Kolonievorming ................................................................................................................................. 19
Migratie ............................................................................................................................................. 19
Invasie................................................................................................................................................ 20
Dose response curve ............................................................................................................................. 21




1

,Les 4: basis celcultuur; cel assay’s
Cel viabiliteit/proliferatie
Celdeling – proliferatie – viabiliteit – cel stress – celdood




Toxiciteit en viabiliteit

Cytotoxiciteitstesten:
Vuistregels:
• Cellen met een snelle deling (dubbelingstijd van minder dan 30 uur)
• Tijdens de exponentiele groeifase
• Nooit onmiddellijk na ontdooien
• De zaaidensiteit moet een snelle celgroei toestaan
• Contact met teststof dient minstens 1 volledige celcyclus te zijn
• Gebruik steeds geschikte positieve en vehikel controles - eindconcentratie van het solvent
(vaak DMSO) zo laag mogelijk (minder dan 0,5%)
o Een vehikel controle bevat het solvent (vaak DMSO) zonder de teststof, om te zien of het solvent zelf al
een effect heeft
• Via dose-response curves kan de IC50 opgesteld worden (concentratie waarbij 50% inhibitie
wordt gezien)




2

, Celproliferatie – viabiliteit

Gebaseerd op aantal cellen:
• Rechtstreeks: bepalen van het aantal cellen in een conditie
• Onrechtstreeks: bepalen van een merker die in relatie staat met het aantal cellen




Viabiliteits assay’s

Aantal cellen bepalen:
• Celtelling
o Effectief celaantal bepalen
o Van celsuspensie:
▪ Ardbeidsintensief: celsuspensie maken van elke conditie/ herhaling
▪ Werken in grote volumes nodig
▪ Gebruik van membraanmerkers
➢ Aantal + viabiliteit bepalen
➢ Bv trypaan blauw
- Impermeabel voor een intacte celmenbraan ~960 dalton
molecule
- Bij permeabele celmembraan telkamer
→ Migratie in de celmembraan
→ Binding aan intracellulaire eiwitten
→ Blauwe cellen = cellen met beschadigde membraan –
merker voor celdood
▪ Manueel: met behulp van telkamer
▪ Automatische celteller




o In cultuurplaten:
▪ Kernkleuring (bv DAPI)– kernen tellen
▪ Cellen / oppervlakte bepalen
▪ Manueel of met software
▪ Vaak in combinatie met andere kleuringen


3