Biotechnologie III
1. Vectoren & kloneringen
1.1. Inleiding
Klonen= aseksueel replicatie van een organismen om genetisch identiek dezelfde organismen te
bekomen
Uitbreiding:
Klonen gaat ook over een gen of gen fragmenten, niet alleen geheel organisme
= kloneren een vreemd gen/gen fragment binnen brengen in een bacterie, zodat die het
gen mee verder kopieert
Toepassingen:
Sequenering van het gen
Aanmaken van een probe voor expressiescreening
Expresseren van het gen in de gastheercel. Uitkomst= grote hoeveelheid eiwitproduct
bekomen
Mutatie van het gen . Uitkomst= veranderde functie van het eiwit bekomen
Recombinante vector bekomen. Uitkomst= hoger orde organisme transgeen maken
2 benaderingswijzen:
1) Cel gebaseerde DNA-klonering
Gewenste fragment in vivo selectief amplificeren
3 essentiële stappen:
1. Keuze van de geschikte bron van het te kloneren DNA
2. Aanleggen van DNA-fragmenten dat in een gastheer/vector kunnen
geïntroduceerd worden
3. Screenen van de bekomen kolonies voor de aanwezigheid van de gewenste DNA
sequentie
=> Alle bacteriën in dezelfde kolonie bevatten dezelfde plasmiden
2) In vitro DNA-klonering
Gewenste fragment in vitro selectief amplificeren
In vitro versus in vivo
In vitro= in glas, experimenteren buiten een levend organisme in een beschermde omgeving
In vivo= in levende, experimenten binnen een levend organisme
1.2. Ligatie
1.2.1. Inleiding
Ligatie= de verbinding tussen de vector en het gen van interesse
Door: enzym DNA ligase
Nicks (=Enkelstrengige breuken) in DNA herstellen
Verbindt de 3’ OH groep met de 5’ fosfaatgroep
Hersteld zowel sticky ends als blunt ends
Uitzonderlijke DNA ligases:
- E. coli DNA ligase enkel sticky ends verbinden
1
, - T4 DNA liagse beide maar niet efficiënt voor blut ends
Vereist ATP (cosubstraat)
Functie: nicks repareren
Reactie:
1. Ligase reageert met ATP= covalent enzyme-AMP complex
2. Covalent enzyme-AMP complex reageert met het 5’-fosfaat van het DNA +
AMP wordt overgedragen aan de fosfaat groep
3. 3’OH reageert met het gevormde complex
= covalente foso-diësterverbinding + AMP vrijgesteld
Opletten:
5’fosfaat is noodzakelijk. Als deze afwezig is (kan door fosfatase)= zal het niet werken
=> Fosfatase kan gebruikt worden om zelfsluiting te verhinderen
Ligase heeft nodig:
DNA
Mg2+
Buffer
ATP
T4ligase
Reactie= overnacht
1.2.2. Optimalisatie van ligatie-condities
Succes ligatie= verwijst naar de efficiëntie/succes van een ligatiereactie
Hoeveel fosfo-diësterverbindingen heb ik kunnen vormen
Belangrijk maar onvoorspelbaar
Factoren die succes ligatie verminderen:
- Aanwezigheid van inhibitoren
- Degradatie van het enzym of DNA
- Niet optimale reactie omstandigheden optimalisatie nodig
Product ligatie= verwijst naar het resultaat van een ligatiereactie
Hoeveel verschillende producten heb ik nu eigenlijk gevormd
1) Monomoleculaire reactie
= concentratie onafhankelijk
2) Bimoleculaire reactie of intermoleculaire reactie
= de verbinding tussen 2 of meerdere verschillende DNA moleculen
Vector – insert
3) Intramoleculaire ligatie= de verbinding binnen hetzelfde DNA molecule
Vector – vector of insert – insert
Concentratie verhogen van vector, niet van insert= meer kans op
intramoleculaire vector – vector reactie
=> Willen we niet
Concentratie verhogen van insert, niet van vector= meer kans op
intramoleculaire insert – insert reactie
=> Willen we ook niet, maar minder probleem
Optimale concentratie vector tot insert= 1:3 tot 3:1 voor sticky end
Optimale concentratie vector tot insert= 1:5 voor blunt ends
2 & 3= concentratie afhankelijk werken met hoge concentraties
2
,Molaire ratio berekenen:
(Wv / Sv) : (Wi / Si)
Wv= gewicht vector (ng)
Sv= grootte vector (bp)
Wi= gewicht insert (ng)
Si= grootte insert (bp)
Oriëntatie van het insert is ook belangrijk => niet gecontroleerd
1.2.3. Voorkomen van ongewenste ligatie: alkalische fosfatase en
dubbeldigeste
2 andere methoden om ongewenste ligatie te voorkomen:
- 5’fosfaatgroep verwijderen van de vector zelfsluiting vermijden
- Toepassen van een dubbele restrictie-digest
1.2.3.1. Defosforylatie van de vector
Verwijderen van 5’fosfaat van DNA, RNA, ribo- en deoxyribonucleosidetrifosfaten door:
- BAP= bacterieel alkalisch fosfatase
- CIP= kalf intestinaal fosfatase
= zelfsluiting van de vector wordt onmogelijk
Ligatie met een insert wel nog, insert heeft zijn 5’ fosfaat nog
Verwijderen van fosfaat VOOR DE LIGATIE
Anders verliest het insert ook zijn 5’fosfaatgroep
In-activatie van het fosfatase= onbetrouwbaar
Dus:
- DNA uit het mengsel halen door:
Anionuitwisselingschromatografie
Fenolextractie gevolgd door een ethanolprecipitatie
Na de ligatie:
Ligatieproduct met 2 nicks= geen probleem
Blijft stabiel door de waterstofbruggen van de basenparing
Wanneer het plasmide getransformeerd wordt, hersteld de bacterie deze nicks bij de
dochtercellen tijdens de replicatie
(Toevoegen van de ontbrekende fosfatasen)
= plasmide wordt vermenigvuldigd in een volledig intacte vorm
1.2.3.2. Defosforylatie van het insert
Bij een heterogeen insert pool (= genomische bank)
Defosforyleren van het insert in plaats van de vector
Ook met :
- BAP
- CIP
= geen multimeren van de inserts kunnen gevormd worden
Multimeren van de inserts= zijn DNA-fragmenten die in meerdere kopieën in een vector zijn
ingebracht tijdens een kloneringsproces
Wel: zelfsluiting van de vector mogelijk
Vermijden door:
Vectoren te gebruiken die enkel tot succesvol getransformeerde bacteriën kunnen leiden
3
, 1.2.3.3. Dubbele restrictie-digest
De 2 elementen voor de ligatie telkens met 2 restrictie-enzymen laten knippen
= ontstaan van niet-compatibele sticky ends
Vaan in MCS= Multiple Cloning Site
Waarom daar?
=> Er is niets van belang aanwezig
Extra stap nodig voor de kloenring met vector?
=> Kleine stukje en de rest van de vector moeten gescheiden worden van elkaar door
preparatieve gel elektroforese
Voordelen:
- De oriëntatie van het insert blijft gecontroleerd tijdens de ligatie
- Zelfsluiting van de vector voorkomen
- Insertie van multimere inserts voorkomen
1.3. Modificatie van DNA uiteinden
Modificatie= het aanpassen van de DNA uiteinden via restrictie-enzymen
Restrictie enzymen kunnen:
- 5’ overhangende ends creëren
- 3’ overhangende ends creëren
1.3.1. Conversie van 3’-uitstekende eindjes tot even eindjes (blut ends)
Verwijderen of opvullen tot een stomp einde
Door: T4 polymerase of klenow fragment (= afgeleid enzym van DNA-polymerase I)
- 5’ 3’ polymerase activiteit
Synthetiseert nucleotiden
- 3’ 5’ exonuclease activiteit
Uitstekende nucleotiden worden verwijderd
- Trifosfaten verhinderd een overdreven exonuclease activiteit
- Enzym heef nodig voor de werking:
4
1. Vectoren & kloneringen
1.1. Inleiding
Klonen= aseksueel replicatie van een organismen om genetisch identiek dezelfde organismen te
bekomen
Uitbreiding:
Klonen gaat ook over een gen of gen fragmenten, niet alleen geheel organisme
= kloneren een vreemd gen/gen fragment binnen brengen in een bacterie, zodat die het
gen mee verder kopieert
Toepassingen:
Sequenering van het gen
Aanmaken van een probe voor expressiescreening
Expresseren van het gen in de gastheercel. Uitkomst= grote hoeveelheid eiwitproduct
bekomen
Mutatie van het gen . Uitkomst= veranderde functie van het eiwit bekomen
Recombinante vector bekomen. Uitkomst= hoger orde organisme transgeen maken
2 benaderingswijzen:
1) Cel gebaseerde DNA-klonering
Gewenste fragment in vivo selectief amplificeren
3 essentiële stappen:
1. Keuze van de geschikte bron van het te kloneren DNA
2. Aanleggen van DNA-fragmenten dat in een gastheer/vector kunnen
geïntroduceerd worden
3. Screenen van de bekomen kolonies voor de aanwezigheid van de gewenste DNA
sequentie
=> Alle bacteriën in dezelfde kolonie bevatten dezelfde plasmiden
2) In vitro DNA-klonering
Gewenste fragment in vitro selectief amplificeren
In vitro versus in vivo
In vitro= in glas, experimenteren buiten een levend organisme in een beschermde omgeving
In vivo= in levende, experimenten binnen een levend organisme
1.2. Ligatie
1.2.1. Inleiding
Ligatie= de verbinding tussen de vector en het gen van interesse
Door: enzym DNA ligase
Nicks (=Enkelstrengige breuken) in DNA herstellen
Verbindt de 3’ OH groep met de 5’ fosfaatgroep
Hersteld zowel sticky ends als blunt ends
Uitzonderlijke DNA ligases:
- E. coli DNA ligase enkel sticky ends verbinden
1
, - T4 DNA liagse beide maar niet efficiënt voor blut ends
Vereist ATP (cosubstraat)
Functie: nicks repareren
Reactie:
1. Ligase reageert met ATP= covalent enzyme-AMP complex
2. Covalent enzyme-AMP complex reageert met het 5’-fosfaat van het DNA +
AMP wordt overgedragen aan de fosfaat groep
3. 3’OH reageert met het gevormde complex
= covalente foso-diësterverbinding + AMP vrijgesteld
Opletten:
5’fosfaat is noodzakelijk. Als deze afwezig is (kan door fosfatase)= zal het niet werken
=> Fosfatase kan gebruikt worden om zelfsluiting te verhinderen
Ligase heeft nodig:
DNA
Mg2+
Buffer
ATP
T4ligase
Reactie= overnacht
1.2.2. Optimalisatie van ligatie-condities
Succes ligatie= verwijst naar de efficiëntie/succes van een ligatiereactie
Hoeveel fosfo-diësterverbindingen heb ik kunnen vormen
Belangrijk maar onvoorspelbaar
Factoren die succes ligatie verminderen:
- Aanwezigheid van inhibitoren
- Degradatie van het enzym of DNA
- Niet optimale reactie omstandigheden optimalisatie nodig
Product ligatie= verwijst naar het resultaat van een ligatiereactie
Hoeveel verschillende producten heb ik nu eigenlijk gevormd
1) Monomoleculaire reactie
= concentratie onafhankelijk
2) Bimoleculaire reactie of intermoleculaire reactie
= de verbinding tussen 2 of meerdere verschillende DNA moleculen
Vector – insert
3) Intramoleculaire ligatie= de verbinding binnen hetzelfde DNA molecule
Vector – vector of insert – insert
Concentratie verhogen van vector, niet van insert= meer kans op
intramoleculaire vector – vector reactie
=> Willen we niet
Concentratie verhogen van insert, niet van vector= meer kans op
intramoleculaire insert – insert reactie
=> Willen we ook niet, maar minder probleem
Optimale concentratie vector tot insert= 1:3 tot 3:1 voor sticky end
Optimale concentratie vector tot insert= 1:5 voor blunt ends
2 & 3= concentratie afhankelijk werken met hoge concentraties
2
,Molaire ratio berekenen:
(Wv / Sv) : (Wi / Si)
Wv= gewicht vector (ng)
Sv= grootte vector (bp)
Wi= gewicht insert (ng)
Si= grootte insert (bp)
Oriëntatie van het insert is ook belangrijk => niet gecontroleerd
1.2.3. Voorkomen van ongewenste ligatie: alkalische fosfatase en
dubbeldigeste
2 andere methoden om ongewenste ligatie te voorkomen:
- 5’fosfaatgroep verwijderen van de vector zelfsluiting vermijden
- Toepassen van een dubbele restrictie-digest
1.2.3.1. Defosforylatie van de vector
Verwijderen van 5’fosfaat van DNA, RNA, ribo- en deoxyribonucleosidetrifosfaten door:
- BAP= bacterieel alkalisch fosfatase
- CIP= kalf intestinaal fosfatase
= zelfsluiting van de vector wordt onmogelijk
Ligatie met een insert wel nog, insert heeft zijn 5’ fosfaat nog
Verwijderen van fosfaat VOOR DE LIGATIE
Anders verliest het insert ook zijn 5’fosfaatgroep
In-activatie van het fosfatase= onbetrouwbaar
Dus:
- DNA uit het mengsel halen door:
Anionuitwisselingschromatografie
Fenolextractie gevolgd door een ethanolprecipitatie
Na de ligatie:
Ligatieproduct met 2 nicks= geen probleem
Blijft stabiel door de waterstofbruggen van de basenparing
Wanneer het plasmide getransformeerd wordt, hersteld de bacterie deze nicks bij de
dochtercellen tijdens de replicatie
(Toevoegen van de ontbrekende fosfatasen)
= plasmide wordt vermenigvuldigd in een volledig intacte vorm
1.2.3.2. Defosforylatie van het insert
Bij een heterogeen insert pool (= genomische bank)
Defosforyleren van het insert in plaats van de vector
Ook met :
- BAP
- CIP
= geen multimeren van de inserts kunnen gevormd worden
Multimeren van de inserts= zijn DNA-fragmenten die in meerdere kopieën in een vector zijn
ingebracht tijdens een kloneringsproces
Wel: zelfsluiting van de vector mogelijk
Vermijden door:
Vectoren te gebruiken die enkel tot succesvol getransformeerde bacteriën kunnen leiden
3
, 1.2.3.3. Dubbele restrictie-digest
De 2 elementen voor de ligatie telkens met 2 restrictie-enzymen laten knippen
= ontstaan van niet-compatibele sticky ends
Vaan in MCS= Multiple Cloning Site
Waarom daar?
=> Er is niets van belang aanwezig
Extra stap nodig voor de kloenring met vector?
=> Kleine stukje en de rest van de vector moeten gescheiden worden van elkaar door
preparatieve gel elektroforese
Voordelen:
- De oriëntatie van het insert blijft gecontroleerd tijdens de ligatie
- Zelfsluiting van de vector voorkomen
- Insertie van multimere inserts voorkomen
1.3. Modificatie van DNA uiteinden
Modificatie= het aanpassen van de DNA uiteinden via restrictie-enzymen
Restrictie enzymen kunnen:
- 5’ overhangende ends creëren
- 3’ overhangende ends creëren
1.3.1. Conversie van 3’-uitstekende eindjes tot even eindjes (blut ends)
Verwijderen of opvullen tot een stomp einde
Door: T4 polymerase of klenow fragment (= afgeleid enzym van DNA-polymerase I)
- 5’ 3’ polymerase activiteit
Synthetiseert nucleotiden
- 3’ 5’ exonuclease activiteit
Uitstekende nucleotiden worden verwijderd
- Trifosfaten verhinderd een overdreven exonuclease activiteit
- Enzym heef nodig voor de werking:
4
