Hoofdstuk 1: Methoden en technieken voor microscopie
Lichtmicroscopie Elektronen microscopie
Klassieke (helder veld) microscopie Transmissie elektronen microscopie
Fasecontrast microscopie Scanning elektronen microscopie
Differentiële interferentie contrast microscopie
Fluorescentie microscopie
Confocale microscopie
3 lenssystemen:
- Condensator: bundelt het licht
- Objectief: beeld het object af
- Oculair: lens om het beeld met het oog te kunnen
waarnemen
4
1) Lichtbron (halogeen/ LED)
2) Stel lenzen om licht te bundelen en op het preparaat te
projecteren (condensator
3) Tafel waarop het object gepositioneerd kan worden
4
4) Een stel lenzen om het beeld te vergroten (objectief en oculair)
3
2
5) Een mechaniek om de lenzen op de juiste afstand van het
object te brengen
5
1
Oculair: lens om het beeld met het oog te kunnen waarnemen
Objectieven: beeldt het object af
Eindvergroting= vergroting objectief x vergroting oculair
Objectieven (voorwerplenzen)
- Gemonteerd op een draaibare revolver
- Lens met gewenste vergroting (2,5x – 100x) wordt boven preparaat gedraaid
- Vormt een vergroot beeld uit het licht dat door het preparaat valt
Oculair (ooglens)
- Vergroot het beeld verder tot een virtueel beeld: 10x
1
,Contrastmicroscopie
= verhogen van contrast in ongekleurde preparaten
(A) Helderveld
(B) Fasecontrast (typisch halo-effect)
= bewerken van kleine faseveranderingen die ontstaan door kleine
brekingsverschillen in het preparaat, zodat deze zich voordoen als
amplitudeveranderingen (licht/donker)
(C) Interferentiecontrast (typisch pseudo-reliëf)
= fasevertragingen die optreden wanneer licht passeert door
transparante objecten met verschillen in brekingsindex
Fluorescentiemicroscopie
- Lokalisatie en kwantificering van fluorescerende moleculen in cellen
- Detectie obv uitzenden van licht aan een specifieke golflengte door een fluorescerende molecule na
absorptie van licht
= fluorescerende stoffen zetten (excitatie)licht van een kortere golflengte om in (emissie)licht van een
langere golflengte.
De lichtbundel passeert in een fluorescentiemicroscoop eerst de excitatiefilter, dat het excitatielicht
beperkt tot een bepaalde golflengte, terwijl het emissielicht, dat door het preparaat wordt uitgezonden,
geleid wordt door een emissiefilter, die de rest van het excitatielicht uit de bundel verwijdert.
Emissielicht
(langere
golflengte)
Excitatielicht (korte golflengte)
Fluorescerende molecule
2
,Technieken voor lichtmicroscopie:
1. Nemen van het weefsel/herkomst van verse weefsels of cellen
• Chirurgische resectie
• Biopsie
o Endoscopische biopt: bij maag/ darmonderzoek: met instrument stukje weefsel uit
maag/ darm halen
o Core needle biopt (CNB): dikke holle naald, naald in patiënt prikken en met holle naald
stukje weefsel naar buiten halen
o Punchbiopt: klein cilindervormig deeltje uit huid verwijderen
o Excisiebiopsie: ellipsvormige snede maken rond letsel om volledig uit te snijden en
meteen te behandelen
o Incisiebiopsie: eerst kleinere incisie maken uit letsel, niet hele letsel verwijderen, daarna
pas behandelen door excisiebiopsie → eerst achterhalen wat het is
• Afzonderlijke cellen
o FNAC (fine needle aspiration): losse cellen opzuigen
o EBUS (endobronchial ultrasound): met bronchoscoop in grote luchtwegen, vanuit
bronchoscoop klein naaldje schieten in lymfeklieren die cellen opzuigen
o Vocht
o Cervixbrush: baarmoederhalsuitstrijkje in baarmoederhals wrijven en cellen afschrapen
• Stalen labelen
• Weefsel inkten op plaatsen waar chirurg heeft gesneden (= snedevlakken) met zwarte chinese
inkt (als tumor tot in inkt gaat → niet helemaal verwijderd)
• Weefsel openknippen/ insnijden (zodat fixatief makkelijk op alle plaatsen van weefsel kan) en
weefsel spoelen
2. Fixatie van het weefsel
= enzymatische processen van cellen onderbreken zodat autolyse verhindert wordt
2 manieren:
- Snap freezing: -180°C (reversibel)
= heel snel op extreem lage temperatuur brengen → eiwitten stoppen met functie uit te
voeren → geen autolyse
Weefsel wordt hierdoor ook hard → vriescoupes maken
- Fixatief: chemische stoffen gebruiken, parrafinecoupes (irreversibel)
Gebaseerd op formalaldehyde
Gebaseerd op alcohol
→ door immersie of perfusie
Immersie:
Vers weefsel onderdompelen in pot met fixatievloeistof
Formol penetreert weefsel met snelheid van 1 mm per uur (reden dat darm wordt
opengeknipt en lever wordt opgesneden)
→ ervoor zorgen dat formol zo diep mogelijk in orgaan kan penetreren
Perfusie:
Fermol wordt ook in het orgaan gespoten (bv in longen)
Fermol = toxisch!!
3
, Medisch luik
Macroscopie en versnijden
= weefsels met blote oog bekijken, beschrijven, tekenen, meten, snedevlakken inkten en weefsel in
kleinere stukken snijden, noteren op tekening waar gesneden
→ beslissen welke stukken weefsel te bekijken onder microscoop en die stukken in cassetjes plaatsen
Technisch luik
1) Inbedden
= weefsel doordringen en omgeven met materiaal van hoge en uniforme hardheid
- Stapsgewijze dehydratatie (water verwijderen)
- Klaring ( alcohol verwijderen dmv tolueen of xyleen)
- Paraffinering
Fixation: Kleine stukjes weefsel worden in oplossingen van chemicaliën geplaatst die conserveren door eiwitten te
verknopen en afbrekende enzymen te inactiveren.
Dehydration: Het weefsel wordt overgebracht via een reeks steeds geconcentreerder wordende
alcoholoplossingen, eindigend in 100%, waardoor al het water wordt verwijderd.
Clearing: Alcohol wordt verwijderd in tolueen of andere middelen waarin zowel alcohol als paraffine mengbaar
zijn.
Infiltration: Het weefsel wordt vervolgens in gesmolten paraffine geplaatst totdat het volledig is geïnfiltreerd met
deze stof.
Embedding: Het met paraffine geïnfiltreerde weefsel wordt in een kleine mal met gesmolten paraffine geplaatst
en laten uitharden.
Trimming: Het resulterende paraffineblok wordt bijgesneden om het weefsel bloot te leggen voor secties (snijden)
op een microtoom. Soortgelijke stappen worden gebruikt bij het voorbereiden van weefsel voor transmissie-
elektronenmicroscopie (TEM), behalve dat speciale fixeermiddelen en -dehydraterende oplossingen worden
gebruikt met kleinere weefselmonsters en inbedding omvat epoxyharsen die harder worden dan paraffine om zeer
dunne secties mogelijk te maken.
2) Coupes snijden met microtoom
= vervaardigen van dunne coupes (5-7 µm dik ) die licht doorlaten (gebeurt met microtoom) en die
monteren op draagglaasje
3) Deparaffineren
= paraffine uit de coupes verwijderen met tuoleen of xyleen, daarna zal men terug hydrateren met
opeenvolgende baden in water/ alcohol, met steeds dalend alcoholgehalte
Door xyleen/ tuoleen lossen lipiden op
→ krijgt artefacten
4
Lichtmicroscopie Elektronen microscopie
Klassieke (helder veld) microscopie Transmissie elektronen microscopie
Fasecontrast microscopie Scanning elektronen microscopie
Differentiële interferentie contrast microscopie
Fluorescentie microscopie
Confocale microscopie
3 lenssystemen:
- Condensator: bundelt het licht
- Objectief: beeld het object af
- Oculair: lens om het beeld met het oog te kunnen
waarnemen
4
1) Lichtbron (halogeen/ LED)
2) Stel lenzen om licht te bundelen en op het preparaat te
projecteren (condensator
3) Tafel waarop het object gepositioneerd kan worden
4
4) Een stel lenzen om het beeld te vergroten (objectief en oculair)
3
2
5) Een mechaniek om de lenzen op de juiste afstand van het
object te brengen
5
1
Oculair: lens om het beeld met het oog te kunnen waarnemen
Objectieven: beeldt het object af
Eindvergroting= vergroting objectief x vergroting oculair
Objectieven (voorwerplenzen)
- Gemonteerd op een draaibare revolver
- Lens met gewenste vergroting (2,5x – 100x) wordt boven preparaat gedraaid
- Vormt een vergroot beeld uit het licht dat door het preparaat valt
Oculair (ooglens)
- Vergroot het beeld verder tot een virtueel beeld: 10x
1
,Contrastmicroscopie
= verhogen van contrast in ongekleurde preparaten
(A) Helderveld
(B) Fasecontrast (typisch halo-effect)
= bewerken van kleine faseveranderingen die ontstaan door kleine
brekingsverschillen in het preparaat, zodat deze zich voordoen als
amplitudeveranderingen (licht/donker)
(C) Interferentiecontrast (typisch pseudo-reliëf)
= fasevertragingen die optreden wanneer licht passeert door
transparante objecten met verschillen in brekingsindex
Fluorescentiemicroscopie
- Lokalisatie en kwantificering van fluorescerende moleculen in cellen
- Detectie obv uitzenden van licht aan een specifieke golflengte door een fluorescerende molecule na
absorptie van licht
= fluorescerende stoffen zetten (excitatie)licht van een kortere golflengte om in (emissie)licht van een
langere golflengte.
De lichtbundel passeert in een fluorescentiemicroscoop eerst de excitatiefilter, dat het excitatielicht
beperkt tot een bepaalde golflengte, terwijl het emissielicht, dat door het preparaat wordt uitgezonden,
geleid wordt door een emissiefilter, die de rest van het excitatielicht uit de bundel verwijdert.
Emissielicht
(langere
golflengte)
Excitatielicht (korte golflengte)
Fluorescerende molecule
2
,Technieken voor lichtmicroscopie:
1. Nemen van het weefsel/herkomst van verse weefsels of cellen
• Chirurgische resectie
• Biopsie
o Endoscopische biopt: bij maag/ darmonderzoek: met instrument stukje weefsel uit
maag/ darm halen
o Core needle biopt (CNB): dikke holle naald, naald in patiënt prikken en met holle naald
stukje weefsel naar buiten halen
o Punchbiopt: klein cilindervormig deeltje uit huid verwijderen
o Excisiebiopsie: ellipsvormige snede maken rond letsel om volledig uit te snijden en
meteen te behandelen
o Incisiebiopsie: eerst kleinere incisie maken uit letsel, niet hele letsel verwijderen, daarna
pas behandelen door excisiebiopsie → eerst achterhalen wat het is
• Afzonderlijke cellen
o FNAC (fine needle aspiration): losse cellen opzuigen
o EBUS (endobronchial ultrasound): met bronchoscoop in grote luchtwegen, vanuit
bronchoscoop klein naaldje schieten in lymfeklieren die cellen opzuigen
o Vocht
o Cervixbrush: baarmoederhalsuitstrijkje in baarmoederhals wrijven en cellen afschrapen
• Stalen labelen
• Weefsel inkten op plaatsen waar chirurg heeft gesneden (= snedevlakken) met zwarte chinese
inkt (als tumor tot in inkt gaat → niet helemaal verwijderd)
• Weefsel openknippen/ insnijden (zodat fixatief makkelijk op alle plaatsen van weefsel kan) en
weefsel spoelen
2. Fixatie van het weefsel
= enzymatische processen van cellen onderbreken zodat autolyse verhindert wordt
2 manieren:
- Snap freezing: -180°C (reversibel)
= heel snel op extreem lage temperatuur brengen → eiwitten stoppen met functie uit te
voeren → geen autolyse
Weefsel wordt hierdoor ook hard → vriescoupes maken
- Fixatief: chemische stoffen gebruiken, parrafinecoupes (irreversibel)
Gebaseerd op formalaldehyde
Gebaseerd op alcohol
→ door immersie of perfusie
Immersie:
Vers weefsel onderdompelen in pot met fixatievloeistof
Formol penetreert weefsel met snelheid van 1 mm per uur (reden dat darm wordt
opengeknipt en lever wordt opgesneden)
→ ervoor zorgen dat formol zo diep mogelijk in orgaan kan penetreren
Perfusie:
Fermol wordt ook in het orgaan gespoten (bv in longen)
Fermol = toxisch!!
3
, Medisch luik
Macroscopie en versnijden
= weefsels met blote oog bekijken, beschrijven, tekenen, meten, snedevlakken inkten en weefsel in
kleinere stukken snijden, noteren op tekening waar gesneden
→ beslissen welke stukken weefsel te bekijken onder microscoop en die stukken in cassetjes plaatsen
Technisch luik
1) Inbedden
= weefsel doordringen en omgeven met materiaal van hoge en uniforme hardheid
- Stapsgewijze dehydratatie (water verwijderen)
- Klaring ( alcohol verwijderen dmv tolueen of xyleen)
- Paraffinering
Fixation: Kleine stukjes weefsel worden in oplossingen van chemicaliën geplaatst die conserveren door eiwitten te
verknopen en afbrekende enzymen te inactiveren.
Dehydration: Het weefsel wordt overgebracht via een reeks steeds geconcentreerder wordende
alcoholoplossingen, eindigend in 100%, waardoor al het water wordt verwijderd.
Clearing: Alcohol wordt verwijderd in tolueen of andere middelen waarin zowel alcohol als paraffine mengbaar
zijn.
Infiltration: Het weefsel wordt vervolgens in gesmolten paraffine geplaatst totdat het volledig is geïnfiltreerd met
deze stof.
Embedding: Het met paraffine geïnfiltreerde weefsel wordt in een kleine mal met gesmolten paraffine geplaatst
en laten uitharden.
Trimming: Het resulterende paraffineblok wordt bijgesneden om het weefsel bloot te leggen voor secties (snijden)
op een microtoom. Soortgelijke stappen worden gebruikt bij het voorbereiden van weefsel voor transmissie-
elektronenmicroscopie (TEM), behalve dat speciale fixeermiddelen en -dehydraterende oplossingen worden
gebruikt met kleinere weefselmonsters en inbedding omvat epoxyharsen die harder worden dan paraffine om zeer
dunne secties mogelijk te maken.
2) Coupes snijden met microtoom
= vervaardigen van dunne coupes (5-7 µm dik ) die licht doorlaten (gebeurt met microtoom) en die
monteren op draagglaasje
3) Deparaffineren
= paraffine uit de coupes verwijderen met tuoleen of xyleen, daarna zal men terug hydrateren met
opeenvolgende baden in water/ alcohol, met steeds dalend alcoholgehalte
Door xyleen/ tuoleen lossen lipiden op
→ krijgt artefacten
4
