Restrictie – analyse
1. Inleiding:
Restrictie-enzymen = endonucleasen (=enzymen die in staat zijn om binnenin een
DNA/RNAmolecuul nucleotiden te hydrolyseren door een fosfodiësterbinding te
verbreken) die in bacteriën voorkomen en deze in staat stellen om voor hen vreemd DNA
af te breken.
- Herkennen bepaalde specifieke basenvolgorde (=sequenties) in het DNA (=
herkenningsplaatsen)
- Gaan in elke streng een fosfodiësterbinding hydrolyseren met vorming van een
3’hydroxyl uiteinde en een 5’fosfaat uiteinde. → dubbelstrengige breuk in het DNA
Bacteriën beschermen zichzelf tegen de inwerking van de eigen restrictie-enzymen door
de herkenningssites in het eigen DNA te modificeren (methyleren) zodat deze niet
verknipt worden. (=specifieke basevolgorden in het DNA waar RE zich aan hechten en
waar ze vervolgens de fosfodiësterbindingen hydrolyseren)
3 types RE:
Type I en III zijn complex en hebben slechts een zeer beperkte rol in de gentechnologie.
Type II Ren zijn van zeer groot belang, door hun specificiteit.
Meeste RE herkennen en knippen een hexanucleotide target site, maar andere
herkennen tetra-, penta-, octanucleotide of zelfs nog langere targets. De
herkenningssites vormen een palindroom (= DNA-sequentie waarvan de
nucleotidenvolgorden op de ene streng hetzelfde zijn als die op de tegenoverliggende
streng, maar in omgekeerde volgorde).
Na het herkennen gebeurt het knippen van de 2 DNA ketens. Hierbij worden 5’ of 3’
uitstekende uiteinden (=sticky ends) gevormd, wat resulteert in even uiteinden (=blunt
ends). EcoRI en PstI activiteit resulteert in de vorming van 5’ uitstekende en 3’
uitstekende uiteinden respectievelijk.
Isoschizomeren = RE geïsoleerd uit versch. bronnen, maar die dezelfde sequentie
herkennen
,Neoschizomeren = RE geïsoleerd uit versch. bronnen, herkennen dezelfde sequentie,
maar verknippen deze op een andere wijze.
2. In silico restrictie-analyse:
In silico = via de computer DNA-sequentiegegevens analyseren om potentiële restrictie-
enzymherkenningssites te identificeren. (NEBcutter)
3. Restrictie-analyse van lambda DNA:
Lambda DNA = genoom van een bacteriofaag, bevat meerdere herkenningssites voor de
RE die gebruikt zullen worden voor de analyse.
Restrictie-digesten worden uitgevoerd door een gepaste hoeveelheid RE toe te voegen
aan ds DNA in aanwezigheid van de geschikte buffer en door dit mengsel vervolgens te
incuberen bij de optimale temperatuur voor het gebruikte RE. De hoeveelheid enzym
wordt uitgedrukt in Units.
1U = de hvh enzym nodig voor het verknippen van 1µg dsDNA in 1 uur bij de optimale
reactiecondities.
Typisch digets = 1-10Uenzym per µg DNA.
Reacties worden 1uur geincubeerd bij de optimale temperatuur, deze is vaak 37°C.
Reactievolume varieert meestal van 10 µL- 25µL voor analytisch digest en 25 – 50 µL
voor een preparatieve digest.
Werkwijze digest:
Uit te voeren restrictie-digesten:
- λ-DNA zonder RE
- λ-DNA + RE 1
- λ-DNA + RE 2
- λ-DNA + RE 3
DNA → 0,25 µg/µL
RE → 20U/µL
verknipt DNA → 1µg
, Door de restrictie-enzymen toe te voegen aan het λ – DNA, zal het DNA verknipt worden
in DNA-fragmenten van verschillende grootte en verschillende conformatie. Hierdoor
kunnen de DNA-moleculen van elkaar gescheiden worden door middel van
agarosegelelektroforese.
Uitleg:
1) Bereken het DNA volume door het verknipte µg te delen door de stockconcentratie
van het DNA (hier: 1/0,25 µg/µL = 4µL)
2) Kijk dan naar het RE, en bereken de hoeveelheid. De hoeveelheid Units mogen zijn 1-
10U, omdat je 1µg verknipt. Dan ga je kijken naar de stockconcentratie, deze is hier 20
U/µL. je doet 10U/20U/µL = 0,5 µL.
3) Dan bereken je de hoeveelheid eindtotaal, door 10% van de RE te doen. Dus hier heb
je minstens 5µL nodig in het eindtotaal, maar je neemt hier 10 voor beter te pipetteren.
4) Je berekend nu de buffer, deze is 1/10 e van het eindtotaal. Hier dus 1µL.
5) Leng dan aan met water tot het eindvolume.
Controle RE 1: PstI RE 2: BamHI RE 3: DraI
dH2O 5 µL 4,5 µL 4,5 µL 4,5 µL
Buffer: 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL
NEBuffer/Cutsmart
Λ-DNA 4 µL 4 µL 4 µL 4 µL
RE 1: PstI - 0,5 µL - -
RE 2: BamHI - - 0,5 µL -
RE 3: DraI - - - 0,5 µL
Totaal volume: 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL
Unit-regel:
Volgens de unit-regel wordt de hoeveelheid restrictie-enzym uitgedrukt in units (U). Eén
unit (U) restrictie-enzym knipt 1 µg DNA in 1 uur bij optimale omstandigheden. Dus als je
bijvoorbeeld 0,6 µg DNA hebt en je wilt een gedeeltelijke digestie uitvoeren, kun je kiezen
voor een hoeveelheid restrictie-enzym tussen 0,6 en 6 units.
Glycerol-regel:
Sommige restrictie-enzymen worden geleverd in een buffer die glycerol bevat om
enzymatische activiteit te behouden. Te veel glycerol kan echter de restrictiedigestie
verstoren. Daarom wordt aanbevolen dat de totale hoeveelheid restrictie-enzymen
(inclusief eventuele glycerol) niet meer dan 1/10e van het totale reactievolume
bedraagt.
1. Inleiding:
Restrictie-enzymen = endonucleasen (=enzymen die in staat zijn om binnenin een
DNA/RNAmolecuul nucleotiden te hydrolyseren door een fosfodiësterbinding te
verbreken) die in bacteriën voorkomen en deze in staat stellen om voor hen vreemd DNA
af te breken.
- Herkennen bepaalde specifieke basenvolgorde (=sequenties) in het DNA (=
herkenningsplaatsen)
- Gaan in elke streng een fosfodiësterbinding hydrolyseren met vorming van een
3’hydroxyl uiteinde en een 5’fosfaat uiteinde. → dubbelstrengige breuk in het DNA
Bacteriën beschermen zichzelf tegen de inwerking van de eigen restrictie-enzymen door
de herkenningssites in het eigen DNA te modificeren (methyleren) zodat deze niet
verknipt worden. (=specifieke basevolgorden in het DNA waar RE zich aan hechten en
waar ze vervolgens de fosfodiësterbindingen hydrolyseren)
3 types RE:
Type I en III zijn complex en hebben slechts een zeer beperkte rol in de gentechnologie.
Type II Ren zijn van zeer groot belang, door hun specificiteit.
Meeste RE herkennen en knippen een hexanucleotide target site, maar andere
herkennen tetra-, penta-, octanucleotide of zelfs nog langere targets. De
herkenningssites vormen een palindroom (= DNA-sequentie waarvan de
nucleotidenvolgorden op de ene streng hetzelfde zijn als die op de tegenoverliggende
streng, maar in omgekeerde volgorde).
Na het herkennen gebeurt het knippen van de 2 DNA ketens. Hierbij worden 5’ of 3’
uitstekende uiteinden (=sticky ends) gevormd, wat resulteert in even uiteinden (=blunt
ends). EcoRI en PstI activiteit resulteert in de vorming van 5’ uitstekende en 3’
uitstekende uiteinden respectievelijk.
Isoschizomeren = RE geïsoleerd uit versch. bronnen, maar die dezelfde sequentie
herkennen
,Neoschizomeren = RE geïsoleerd uit versch. bronnen, herkennen dezelfde sequentie,
maar verknippen deze op een andere wijze.
2. In silico restrictie-analyse:
In silico = via de computer DNA-sequentiegegevens analyseren om potentiële restrictie-
enzymherkenningssites te identificeren. (NEBcutter)
3. Restrictie-analyse van lambda DNA:
Lambda DNA = genoom van een bacteriofaag, bevat meerdere herkenningssites voor de
RE die gebruikt zullen worden voor de analyse.
Restrictie-digesten worden uitgevoerd door een gepaste hoeveelheid RE toe te voegen
aan ds DNA in aanwezigheid van de geschikte buffer en door dit mengsel vervolgens te
incuberen bij de optimale temperatuur voor het gebruikte RE. De hoeveelheid enzym
wordt uitgedrukt in Units.
1U = de hvh enzym nodig voor het verknippen van 1µg dsDNA in 1 uur bij de optimale
reactiecondities.
Typisch digets = 1-10Uenzym per µg DNA.
Reacties worden 1uur geincubeerd bij de optimale temperatuur, deze is vaak 37°C.
Reactievolume varieert meestal van 10 µL- 25µL voor analytisch digest en 25 – 50 µL
voor een preparatieve digest.
Werkwijze digest:
Uit te voeren restrictie-digesten:
- λ-DNA zonder RE
- λ-DNA + RE 1
- λ-DNA + RE 2
- λ-DNA + RE 3
DNA → 0,25 µg/µL
RE → 20U/µL
verknipt DNA → 1µg
, Door de restrictie-enzymen toe te voegen aan het λ – DNA, zal het DNA verknipt worden
in DNA-fragmenten van verschillende grootte en verschillende conformatie. Hierdoor
kunnen de DNA-moleculen van elkaar gescheiden worden door middel van
agarosegelelektroforese.
Uitleg:
1) Bereken het DNA volume door het verknipte µg te delen door de stockconcentratie
van het DNA (hier: 1/0,25 µg/µL = 4µL)
2) Kijk dan naar het RE, en bereken de hoeveelheid. De hoeveelheid Units mogen zijn 1-
10U, omdat je 1µg verknipt. Dan ga je kijken naar de stockconcentratie, deze is hier 20
U/µL. je doet 10U/20U/µL = 0,5 µL.
3) Dan bereken je de hoeveelheid eindtotaal, door 10% van de RE te doen. Dus hier heb
je minstens 5µL nodig in het eindtotaal, maar je neemt hier 10 voor beter te pipetteren.
4) Je berekend nu de buffer, deze is 1/10 e van het eindtotaal. Hier dus 1µL.
5) Leng dan aan met water tot het eindvolume.
Controle RE 1: PstI RE 2: BamHI RE 3: DraI
dH2O 5 µL 4,5 µL 4,5 µL 4,5 µL
Buffer: 1 µL 1 µL 1 µL 1 µL
NEBuffer/Cutsmart
Λ-DNA 4 µL 4 µL 4 µL 4 µL
RE 1: PstI - 0,5 µL - -
RE 2: BamHI - - 0,5 µL -
RE 3: DraI - - - 0,5 µL
Totaal volume: 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL
Unit-regel:
Volgens de unit-regel wordt de hoeveelheid restrictie-enzym uitgedrukt in units (U). Eén
unit (U) restrictie-enzym knipt 1 µg DNA in 1 uur bij optimale omstandigheden. Dus als je
bijvoorbeeld 0,6 µg DNA hebt en je wilt een gedeeltelijke digestie uitvoeren, kun je kiezen
voor een hoeveelheid restrictie-enzym tussen 0,6 en 6 units.
Glycerol-regel:
Sommige restrictie-enzymen worden geleverd in een buffer die glycerol bevat om
enzymatische activiteit te behouden. Te veel glycerol kan echter de restrictiedigestie
verstoren. Daarom wordt aanbevolen dat de totale hoeveelheid restrictie-enzymen
(inclusief eventuele glycerol) niet meer dan 1/10e van het totale reactievolume
bedraagt.
