Samenvatting - Practicum: biochemie en biotechnologie, PCR (J000496A)

Practicum PCR


 DNA-profiel: DNA fingerprint
o DNA-profiel dat wordt verkregen, vergelijken met dat van de verdachte
 Vingerafdrukken: dactyloscopie
 ‘match’ of ‘geen match’: verdachte wordt gelinkt of uitgesloten


DNA in de cel

In de kern = nucleair DNA/Genomisch DNA

 Chromosomen
 Uniek

In het cytosol = mitochondriaal DNA


Genomisch DNA

Coderend DNA (‘genen’)

 Genetische informatie
 Coderen voor eiwitten

Niet-coderend DNA (‘extra genetisch’)

 Junk DNA
 Grootste deel van het genoom
 Geen fenotypische kenmerken
o Uitzondering: het geslacht
 We zoeken naar regio’s in het DNA die verschillen tussen personen


Variabele regio’s in het
DNA = Short Tandem Repeats (STRs)

 Identieke, repetitieve units
o Analyse van kleine fragmenten
 Zeer polymorf
 Merkers selecteren zover mogelijk van elkaar
in het genoom, op verschillende
chromosomen
 Geslacht: Amelogenine merker op het
geslachtschromosoom: XX of XY

Locus: plaats op het genoom, waar de merker zich bevindt
Allel: varianten van een merker (aantal repeats)
Homozygoot: allelen op beide chromosomen zijn gelijk
Heterozygoot: Allelen van een bepaalde merker op beide chromosomen zijn verschillend

Opstellen DNA-profiel

,  Cellen losweken van de dragen (bv. speekselcellen)
 DNA extraheren uit de cellen mvb Chelex
o Chelex: hars, in de oplossing zullen minder ionen zitten
 Osmotische kracht: cel neemt water op
 Concentratie aan ionen in de cel daalt, en
wordt gelijk aan de concentratie van ionen
buiten de cel
 Door de osmotische druk zal de cel barsten
 Zachte lyse bij 56°C  osmose (cellen komen allemaal op barsten te
staan)
 Harde lyse bij kooktemperatuur  openbreken cellen en denaturatie
van de proteïnen (DNA is vrijgekomen)
 Vrijgekomen DNA beschermen voor afbraak door DNasen
o Afcentrifugeren: zware materiaal (bv. Chelex) op de bodem, DNA opgelost in de
waterige oplossing (= supernatans)
 Goed scheiden want Chelex zal ionen capteren die het enzym tijdens de PCR
nodig heeft
 DNA vermenigvuldigen adhv PCR:
o Detectie van de DNA-fragmenten mbv capillaire electroforese
o = DNA-amplificatie
o DNA-polymerase nodig (Taq)
 Organisme dat bij kooktemperaturen overleeft,
polymerase zal niet denatureren
o Enkelstrengig DNA nodig als ‘template’ voor synthese van
complementaire nieuwe streng
o Klein stukje dubbelstrengig DNA nodig om de polymerase te
starten (primers toevoegen)
 Cycli van denaturatie, annealing en elongatie
 Denaturatie van een dubbelstrengige helix,
enkelstrengig DNA maken
 Annealing: kleine regio’s met nieuw dubbelstrengig DNA wordt gemaakt
 Hiervoor primers (enkelstrengig DNA) aangemaakt: zijn
complementair met fragment van template DNA
 Temperatuur verlagen naar 58°C zodat enkel de primers kunnen
binden/hybridiseren op het DNA
 Polymerase bindt op deze nieuw gevormde stukjes
 Annealing T: primers binden = smelttemperatuur v. DNA
 Smelttemperatuur v. DNA
o 50% primers gebonden aan DNA
o Afh. v. [C] en [G] gehalte (hebben 3 H-bruggen ipv. 2 H-
bruggen bij A en T)
o Hoe meer H-bruggen, hoe sterker de reactie, hoe meer
energie nodig, hoe hoger smelttemperatuur
 Voor elk fragment bij het begin en einde een primer toevoegen
o Smelttemperatuur v. beide primers moet gelijk zijn zodanig
dat er geen aspecifieke bindingen kunnen plaatsvinden
o Tm te laag (tov. Ta) : geen annealing