samenvatting practicum biochemie en biotechnologie

Opzuivering en identificatie van DNA= pDNA

Inleiding:

- pDNA
o pDNA= cirkelvormige dubbele streng DNA
o Ligt buiten chromosomaal DNA
o Genetische info tsn bacteriën uitwisselen
o Kunnen alleen of met honderden in een cel/ bacterie zitten
o Dragen minstens 1 gen
o Kan onafhankelijk repliceren
 Origin of replication
o Selectiemarker: gen dat resistentie tegen bepaald antibioticum is

- Plasmide= buiten chromosoom van eencellige organismen
o 3 belangrijke locaties
 Origin of replication: replicatie start hier
 Multiple cloning site (MPS): sequentie met herkenningssites voor RE
 Antibiotica resistentiegen-> selectie

- Kunstmatige plasmiden
o Vaak gebruikt voor genetische modificaties uit te voeren
o Stukken DNA met gewenste eigenschappen aan cel toevoegen
o Gentherapie hiermee
o In wetenschappelijk onderzoek:
 Vaak gebruikt om bepaalde structuren fluorescent te kleuren
 Plasmiden met GFP (green fluorescent protein)



- Restrictie-enzymen
o Herkent specifieke DNA-sequenties → knipt DNA strengt daar doormidden
o Kunstmatig kan men een nieuw DNA stuk invoegen
o Elk restrictie-enzym → eigen specifieke nucleotidenvolgorde
o Enzym dat een specifieke DNA-sequentie herkent (recognition site) en deze doorknipt
 Enzymen knippen bij verschillende plasmiden op verschillende plaatsen
 Fragmenten van verschillende groottes
o M.b.v. restrictie: nieuwe genen in plasmide brengen
o 4-8 nucleotiden lang
o Je kan er plasmide mee identificeren
 1 enzym knipt in verschillende plasmiden op verschillende plaatsen=> fragmenten van
verschillende groottes
 => nieuw stuk DNA kan ingevoerd w
o Hierna volgt DNA ligase: plakt het plasmide met nieuwe gen terug toe
o Bacteriën w gekweekt in een geschikt medium dat de juiste antibiotica bevat=> enkel bacteriën die
het plasmide bevatten (én het antibioticumresistentiegen) zijn in staat om te groeien
1

,  Hierna w bacteriën gelyseerd om de plasmiden te isoleren, nu komt de zuivering

- Vermeerderen van pDNA in bacteriën
o Gewenst plasmide verkregen → opkweken in bacteriën
o Antibiotica rijk medium → enkel plasmiden overleven met
antibioticumresistentie
o Na groeiperiode → gelyseerd om plasmiden te isoleren




2

, DNA opzuivering




1.a Lyse van bacteriën 2. Binden van DNA aan silica-kolom 3. Wasstappen
- Om DNA te isoleren - Supernatans op silica kolom brengen - Wassen met zout/ethanol oplossing
- “lysis buffer” - Silica & DNA negatief geladen o Verwijdert onzuiverheden
o Bevat enzymen & o Stoten elkaar af  Eiwitten
surfactanten - MAAR we gebruiken een oplossing  Overtollige zouten
o Maken celwand bacteriën met een lage pH (veel positief geladen o pDNA nog steeds gebonden aan
kapot protonen) & hoge zoutconcentratie silica
- Inhoud komt vrij (veel positieve tegenionen, Na+)
o Negatieve lading DNA & silica
afgeschermd 4. Elutie
1.b Centrifugatie o => DNA zal binden op silica
- Elutiebuffer op kolom brengen
- Grote celresten (pellet) & o Hoge pH (weinig protonen) & lage
macromoleculen (supernatans) zoutconcentratie (weinig tegen-ionen)
gescheiden Als we niet gebruik maken van een lage pH
oplossing zal DNA niet kunnen binden op het o Negatieve lading niet meer
- (in practicum beginnen we vanaf stap 2 silica afgeschermd
met het supernatans) o pDNA komt los van de kolom
tijdens centrifugatie
- pDNA nu in het eluens (onbekende
Pellet: korrels concentratie)
Supernatans: vloeistof die na
3
het centrifugeren vrijkomt