Moleculaire biologie – labotest
Bioveiligheid en afspraken L2-labo
Gebruik handschoenen
Handschoenen AAN:
- Jezelf beschermen tegen: bloed, pathogenen, chemicaliën
- Je materiaal beschermen: steriel werken, Rnase-vrij werken, DNA contaminatie voorkomen
Handschoenen UIT:
- Je omgeving beschermen
o Na contact met bloed, pathogenen, chemicaliën
o Buiten het labo (1 handschoen bij transport)
o Voor contact met labo toestellen
o Voor contact met meubilair (kast, kraan, klink, …)
o Voor contact met persoonlijk materiaal (balpen, papier, GSM, …)
o Voor contact met huis (gezicht, handen, …)
o Bij beschadiging
In en uit L2-labo
Niet naar BINNEN:
- Voeding en drank
- Jassen en tassen
- Schrijfgerief
- Rekentoestel
- GSM
- Laptop
- Labomateriaal uit chemielabo’s
1
,Niet naar BUITEN:
- Balpennen en stiften
- Laptop lectoren
- Labojassen met bioveiligheidslabel
- Labomateriaal
Stappenplan epje openen
1. Controleer het label
2. Ontdooi volledig
3. Mengen/vortexen
4. Centrifugeren
5. Open het epje
Specifieke veiligheidsvoorschriften voor practicum moleculaire biologie
- Leg geen schriften en/of boeken op je laboratoriumtafel tijdens het uitvoeren van een
experiment
- Wees zuinig met reagentia
- Werken met eukaryote cellijnen, humane cellenen bloed: correct gebruik van de veiligheidskast
ter bescherming van het experiment en de onderzoeker
- Contaminatievoorkomen bij het uitvoeren van PCR
- Werken met Sybr Green (alternatief voor het meer toxische ethidiumbromide)
Werken met micropipet
- hang de pipetten zorgvuldig in het bijhorende rekje
- breng zorgvuldig een gepaste en zuivere tip aan op de pipettor
- respecteer de uiterste limieten van je pipet-stel het volume in van hoge naar lage stand
- duw de pipet in tot je de eerste weerstand voelt
- plaats de pipetpunt vertikaal en op de juiste diepte in de oplossing
- 1-2 mm voor P10, P20, P100 en P200
- 2-4 mm voor P1000
- 3-6 mm voor P5000
- zuig de oplossing zachtjes op (er mogen geen luchtbellen in zitten) en duw de vloeistof uit onder
een hoek van 20° tot 45° in het gewenste recipiënt
!! Syllabus lezen (in bijlage)
2
, Practicum 1: Humaan gDNA-isolatie en bepalen concentratie en zuiverheid DNA
Leerdoelen:
- HumaangDNA kunnen isoleren uit bloed of celpellet door middel van de silica-
membraantechnologie (kolomchromatografie)
- De kwantiteit en de kwaliteit van het geïsoleerde DNA door middel van spectrofotometrie
(Nanodrop) kunnen bepalen
- Bioveiligwerkenin eenL2-lab
- Correct met de micropipetlerenwerken
- Correct eenmicrocentrifuge kunnengebruiken
bepaling
PCR-amplificatie agarose
DNA-isolatie concentratie en
STR merker gelelektroforese
zuiverheid
Doel gDNA-isolatie
Zuiver DNA afzonderen uit bloed, speekselof uit een celpellet van cultuurcellen met de bedoeling in een
volgend practicum een PCR-analyse uit te voeren op het DNA.
Principe gDNA-isolatie
- Lyse van de cellen
- Verwijderen van contaminanten (proteïnen,...)
- Afzonderen van het DNA
gDNA-isolatie
Lyse van de cellen
- Cellen, weefsel in lysebuffer (≠ PBS: phosphatebuffersaline à zoutbuffer)
Verwijderen van
Celwand, contaminanten
celmembraan
- kapot maken
Verwijderen contaminanten
en van het Elueren van het
A aan de DNA van de
Adsorption = binden van het DNA
drager drager
aan de drager
Elution = elueren van het DNA
van de drager
3
, bepaling
PCR-amplificatie agarose
DNA-isolatie concentratie en
STR merker gelelektroforese
zuiverheid
gDNA-isolatie
Bepalen van de concentratie en zuiverheid van DNA/RNA
Bepalen van de concentratie en zuiverheid van
Spectrofotometer
gDNA-isolatie het DNA/RNA
λ = 260 nm à Bij deze golflengte absorberen de dubbele bindingen van purine en pyrimidine
A =• 1 ➔
Spectrofotometer
c = 50 µg/ml DNA
Bepalen van de concentratie en zuiverheid van
➔ c = 40 µg/ml RNA
het DNA/RNA λ = 260 nm
Bij deze golflengte absorberen de
• Spectrofotometer dubbele bindingen van purine en
pyrimidine
A = 1 ➔ c = 50 µg/ml DNA
→ c = 40 µg/ml RNA
λ = 260 nm
Kwaliteitscontrole DNA
Bij deze golflengte absorberen de
Toestellen VESA: dubbele bindingen van purine en
NA - Nanodrop 2000: concentratie, zuiverheid pyrimidine
ole DNA A = 1 ➔ c = 50 µg/ml DNA
→ c = 40 µg/ml RNA
SA
0
zer - Agilent 2100 bio-analyzer: concentratie
o-analyzer
4
Bioveiligheid en afspraken L2-labo
Gebruik handschoenen
Handschoenen AAN:
- Jezelf beschermen tegen: bloed, pathogenen, chemicaliën
- Je materiaal beschermen: steriel werken, Rnase-vrij werken, DNA contaminatie voorkomen
Handschoenen UIT:
- Je omgeving beschermen
o Na contact met bloed, pathogenen, chemicaliën
o Buiten het labo (1 handschoen bij transport)
o Voor contact met labo toestellen
o Voor contact met meubilair (kast, kraan, klink, …)
o Voor contact met persoonlijk materiaal (balpen, papier, GSM, …)
o Voor contact met huis (gezicht, handen, …)
o Bij beschadiging
In en uit L2-labo
Niet naar BINNEN:
- Voeding en drank
- Jassen en tassen
- Schrijfgerief
- Rekentoestel
- GSM
- Laptop
- Labomateriaal uit chemielabo’s
1
,Niet naar BUITEN:
- Balpennen en stiften
- Laptop lectoren
- Labojassen met bioveiligheidslabel
- Labomateriaal
Stappenplan epje openen
1. Controleer het label
2. Ontdooi volledig
3. Mengen/vortexen
4. Centrifugeren
5. Open het epje
Specifieke veiligheidsvoorschriften voor practicum moleculaire biologie
- Leg geen schriften en/of boeken op je laboratoriumtafel tijdens het uitvoeren van een
experiment
- Wees zuinig met reagentia
- Werken met eukaryote cellijnen, humane cellenen bloed: correct gebruik van de veiligheidskast
ter bescherming van het experiment en de onderzoeker
- Contaminatievoorkomen bij het uitvoeren van PCR
- Werken met Sybr Green (alternatief voor het meer toxische ethidiumbromide)
Werken met micropipet
- hang de pipetten zorgvuldig in het bijhorende rekje
- breng zorgvuldig een gepaste en zuivere tip aan op de pipettor
- respecteer de uiterste limieten van je pipet-stel het volume in van hoge naar lage stand
- duw de pipet in tot je de eerste weerstand voelt
- plaats de pipetpunt vertikaal en op de juiste diepte in de oplossing
- 1-2 mm voor P10, P20, P100 en P200
- 2-4 mm voor P1000
- 3-6 mm voor P5000
- zuig de oplossing zachtjes op (er mogen geen luchtbellen in zitten) en duw de vloeistof uit onder
een hoek van 20° tot 45° in het gewenste recipiënt
!! Syllabus lezen (in bijlage)
2
, Practicum 1: Humaan gDNA-isolatie en bepalen concentratie en zuiverheid DNA
Leerdoelen:
- HumaangDNA kunnen isoleren uit bloed of celpellet door middel van de silica-
membraantechnologie (kolomchromatografie)
- De kwantiteit en de kwaliteit van het geïsoleerde DNA door middel van spectrofotometrie
(Nanodrop) kunnen bepalen
- Bioveiligwerkenin eenL2-lab
- Correct met de micropipetlerenwerken
- Correct eenmicrocentrifuge kunnengebruiken
bepaling
PCR-amplificatie agarose
DNA-isolatie concentratie en
STR merker gelelektroforese
zuiverheid
Doel gDNA-isolatie
Zuiver DNA afzonderen uit bloed, speekselof uit een celpellet van cultuurcellen met de bedoeling in een
volgend practicum een PCR-analyse uit te voeren op het DNA.
Principe gDNA-isolatie
- Lyse van de cellen
- Verwijderen van contaminanten (proteïnen,...)
- Afzonderen van het DNA
gDNA-isolatie
Lyse van de cellen
- Cellen, weefsel in lysebuffer (≠ PBS: phosphatebuffersaline à zoutbuffer)
Verwijderen van
Celwand, contaminanten
celmembraan
- kapot maken
Verwijderen contaminanten
en van het Elueren van het
A aan de DNA van de
Adsorption = binden van het DNA
drager drager
aan de drager
Elution = elueren van het DNA
van de drager
3
, bepaling
PCR-amplificatie agarose
DNA-isolatie concentratie en
STR merker gelelektroforese
zuiverheid
gDNA-isolatie
Bepalen van de concentratie en zuiverheid van DNA/RNA
Bepalen van de concentratie en zuiverheid van
Spectrofotometer
gDNA-isolatie het DNA/RNA
λ = 260 nm à Bij deze golflengte absorberen de dubbele bindingen van purine en pyrimidine
A =• 1 ➔
Spectrofotometer
c = 50 µg/ml DNA
Bepalen van de concentratie en zuiverheid van
➔ c = 40 µg/ml RNA
het DNA/RNA λ = 260 nm
Bij deze golflengte absorberen de
• Spectrofotometer dubbele bindingen van purine en
pyrimidine
A = 1 ➔ c = 50 µg/ml DNA
→ c = 40 µg/ml RNA
λ = 260 nm
Kwaliteitscontrole DNA
Bij deze golflengte absorberen de
Toestellen VESA: dubbele bindingen van purine en
NA - Nanodrop 2000: concentratie, zuiverheid pyrimidine
ole DNA A = 1 ➔ c = 50 µg/ml DNA
→ c = 40 µg/ml RNA
SA
0
zer - Agilent 2100 bio-analyzer: concentratie
o-analyzer
4
