samenvatting practicum biochemie &biotechnologie

SAMENVATTING Practicum biochemie en
biotechnologie

Plasmide DNA


Inleiding
DNA
- Volgorde nucleotiden bepaalt EW
- Bepaalt erfelijke eigenschappen organisme
Plasmide DNA
- Cirkelvormige dubbele streng DNA
- Grootte : 1 000 – 200 000 bp
- Functie : genetische info tussen bacteriën
uitwisselen.
- Dragen altijd ten minste 1 gen
 Gunstig voor bacterie:
 Nieuwe voedselbronnen aanspreken
 Gifstoffen aanmaken
 Resistentie tegen bepaalde antibiotica
- Onafhankelijk repliceren
 Bevat stuk DNA dat dient als startpunt voor replicatie ‘origin of replication’
- Plasmiden artificieel aangemaakt bevatten selectiemarket
 = een gen dat resistentie verschaft tegen bepaald antibioticum bv. Ampiciline
- Kunstmatige plasmiden : gebruikt om genetische modificaties uit te voeren.
 Samengesteld uit DNA de gewenste eigenschappen aan cel kunnen
toevoegen/veranderen
 Bepaalde structuren fluorescent aan kleuren
- Nieuwe genen bv. Insuline, GFP-actine worden in plasmide aangebracht m.b.v.
Restrictie-enzymen.
Restrictie-enzymen
Herkent specifieke DNA sequentie ( recognition site )
 Knipt op die plek beide strengen
 Vergemakkelijken invoeging van nieuwe genen in plasmide.
Vermeerderen van pdna in bacteriën
- Gewenste plasmide w opgewekt in bacteriën
- Bacteriën groeien in geschikte medium met antibiotica .
- Alleen bacteriën met plasmide en antibioticaresistentie groeien

1

, - Na groeiperiode worden bacteriën opengebroken
- Plasmiden geïsoleerd en DNA opgezuiverd

DNA opzuivering
Overzicht
- De opzuiveringsstappen die doorlopen
worden zijn:
- bacteriën lyseren om DNA te isoleren
- binden van het DNA aan de silica-kolom
- was-stappen om onzuiverheden weg te
wassen
- elutie van het DNA van de kolom


lyseren van bacteriën
- lysis-buffer om plasmide uit bacterie te isoleren
 bevat enzymen en surfactanten die de celwand van de bacteriën kapot maakt=>
inhoud bacterie komt vrij => plasmide ook
- centrifugatie
 grote celresten in pellet
 macromoleculen in supernatans


Binden van DNA aan de silica-kolom
- Supernatans word op silica-kolom gebracht
- DNA en silica = negatief geladen
 DNA afgestoten door silica
- DNA zal toch kunenn binden aan silica doordat we een oplossing toevoegen met een
lage pH (veel protonen => + ladingen) + een hoge zoutconcentratie ( veel positieve
tegenionen)


Wasstappen
- Zodra PdnA aan silica membraan is
gebonden
- Gewassen met zout-ethanol oplossing
 Verwijderd onzuiverheden : EW ,
overtollige zouten…
- DNA blijft aan silica gebonden


Elutie

2

, - Elutiebuffer op silica-kolom
 Heeft hoge ph (weinig protonen)
 Lage zoutconcentratie (geen/weinig positieve tegen-
ionen)
 Gevolg : pdna zal loskomen van silica tijdens
centrifugatie
HET DNA BEVIND ZICH NU IN HET ELUENS !!!


DNA concentratie bepalen via UV/VIS spectroscopie
- Eluens bevat onbekende concentratie plasmide DNA
- Concentratie bepaalt door UV/VIS spectroscopie
 DNA : absorbantie max = 260nm
 Onzuiverheden absorbantie max = 230 nm &
280nm
 Men kan zuiverheid nagaan a.d.h.v. deze
absorbanties



DNA identificatie : Gel elektroforese
DRAGEN VAN HANDSCHOENEN EN VEILIGHEIDSBRIL IS VERPLICHT VOOR DIT ONDERDEEL !
Maken van de gel
- Agarose opgelost in buffer door verwarmen.
 Toevoegen gelred (= kleurstof die aan DNA bindt en het fluorescent maakt)
- Oplossig in gelhouder gieten en 20min wachten tot het solideert
Laden van de gel
- De DNA-ladder + alle stalen worden in de gel geladen
Lopen van de gel
- Na inladen => elektroden aansluiten
 Constant voltage : voor 40min-90min
Gedurende deze tijd zal het negatief geladen DNA van de negatieve naar de
positieve elektrode migreren.
UV-detectie
- DNA-bandjes gedetecteerd met behulp van UV licht
- De ladder : helpt bij identificeren van de groottes van de DNA stalen.
Zie video : interpretatie van de gel



3