Hoofdstuk 2: vloeistofchromatografie
Algemeen chromatografie
Chromatografie = een aantal analytische scheidingsmethoden die er voor zorgen dat een
mengsel van stoffen gescheiden wordt in zijn samenstellende componenten
Alle chromatografische technieken steunen op de verdeling van de te scheiden
componenten over twee fasen.
o stationaire fase = niet-bewegende vaste fase die door een geschikte
drager op zijn plaats gehouden wordt
o mobiele fase = bewegende fase stroomt langs de stationaire
De verschillen in verdeling zorgen ervoor dat de componenten van het mengsel met
verschillende snelheden door het chromatografisch systeem meegevoerd worden waardoor
de scheiding van de componenten tot stand komt
Voorbeeld uit labo
In labo: mengsel van cafeïne en theofylline wordt gescheiden door hun verschil in polariteit
de ene component door het systeem meer vertraagd dan de andere
Hierdoor bereiken cafeïne en theofylline op een verschillend ogenblik de detector en dit
resulteert in een chromatogram met 2 pieken, 1 piek per component
Door minimaal verschil in structuurformule ( hier 1 methyl- of CH3 – groep) beiden een
andere aantrekking tot de mobiele en/of stationaire fase = verschil in moment voor het
bereiken van de detector
Dit is te zien op het chromatogram met dit chromatogram kan dan verder gewerkt
worden om concentraties te bepalen en besluiten te trekken
Cafeïne bevat 1 methylgroep meer dan theofylline, cafeïne is dus meer aangetrokken door de
stationaire fase. De extra methylgroep zorgt ervoor dat cafeïne apolairder is dan theofylline
en apolair is aangetrokken tot apolair. De C18 is een kolom waar silica gemodificeerd is met
C18-ketens, dit zorgt ervoor dat de kolom apolair is. Theofylline migreert makkelijker mee
met de mobiele fase omdat deze groep polairder is dan cafeïne. Theofylline zal dus eerst de
detector bereiken en ook de eerste piek op het chromatogram zal vertegenwoordigen.
HPLC of high performance liquid chromatography
De verschillende onderdelen van het toestel zijn:
, o solventvoorziening + filterkorf
o pomp
o injectiekraan
o kolom
o detector
o afvalvat
o datasysteem
= eluensreservoirbevat
de
vloeistoffen waaruit het
eluens zal samengesteld
worden (MF)
1. In eluensreservoir: voorkomen dat in de pomp of in de detector gasbellen ontstaan =
opgeloste lucht in deze solventen verwijderen
o opgeloste lucht wegnemen door te strippen met helium (zeer lage
oplosbaarheid in vloeistoffen)
o dit door onder vacuüm te plaatsen, te koken onder reflux of te ontgassen in
het ultrasoon bad (labo)
2. Aan het einde van elke aanzuigleiding filterkorf
o met een porositeit van 5 µm
o om stofdeeltjes tegen te houden dit dient ervoor om de pompkleppen te
beschermen
3. De in gepaste verhouding aangezogen solventen worden na doorgang door de
mengkamer door de hogedrukpomp naar de injector en kolom gestuurd
o Pomp: dient een zo constant mogelijk pulsvrij debiet te leveren (10 µl tot 10
ml/min)
om pulsvrije stroming te bekomen = gebruik maken van 2
alternerende plunjerkoppen (=pomp) dit pompsysteem zorgt voor
een pulsvrije stroom doordat de ene plunjerkop vloeistof (eluens) naar
de kolom stuurt, terwijl de andere eluens aanzuigt
eluensvoorziening
vloeistofreservoirs bevatten de MF die frequent bestaat uit: water, waterige
bufferoplossingen, mengsels van water en organische oplosmiddelen of
Algemeen chromatografie
Chromatografie = een aantal analytische scheidingsmethoden die er voor zorgen dat een
mengsel van stoffen gescheiden wordt in zijn samenstellende componenten
Alle chromatografische technieken steunen op de verdeling van de te scheiden
componenten over twee fasen.
o stationaire fase = niet-bewegende vaste fase die door een geschikte
drager op zijn plaats gehouden wordt
o mobiele fase = bewegende fase stroomt langs de stationaire
De verschillen in verdeling zorgen ervoor dat de componenten van het mengsel met
verschillende snelheden door het chromatografisch systeem meegevoerd worden waardoor
de scheiding van de componenten tot stand komt
Voorbeeld uit labo
In labo: mengsel van cafeïne en theofylline wordt gescheiden door hun verschil in polariteit
de ene component door het systeem meer vertraagd dan de andere
Hierdoor bereiken cafeïne en theofylline op een verschillend ogenblik de detector en dit
resulteert in een chromatogram met 2 pieken, 1 piek per component
Door minimaal verschil in structuurformule ( hier 1 methyl- of CH3 – groep) beiden een
andere aantrekking tot de mobiele en/of stationaire fase = verschil in moment voor het
bereiken van de detector
Dit is te zien op het chromatogram met dit chromatogram kan dan verder gewerkt
worden om concentraties te bepalen en besluiten te trekken
Cafeïne bevat 1 methylgroep meer dan theofylline, cafeïne is dus meer aangetrokken door de
stationaire fase. De extra methylgroep zorgt ervoor dat cafeïne apolairder is dan theofylline
en apolair is aangetrokken tot apolair. De C18 is een kolom waar silica gemodificeerd is met
C18-ketens, dit zorgt ervoor dat de kolom apolair is. Theofylline migreert makkelijker mee
met de mobiele fase omdat deze groep polairder is dan cafeïne. Theofylline zal dus eerst de
detector bereiken en ook de eerste piek op het chromatogram zal vertegenwoordigen.
HPLC of high performance liquid chromatography
De verschillende onderdelen van het toestel zijn:
, o solventvoorziening + filterkorf
o pomp
o injectiekraan
o kolom
o detector
o afvalvat
o datasysteem
= eluensreservoirbevat
de
vloeistoffen waaruit het
eluens zal samengesteld
worden (MF)
1. In eluensreservoir: voorkomen dat in de pomp of in de detector gasbellen ontstaan =
opgeloste lucht in deze solventen verwijderen
o opgeloste lucht wegnemen door te strippen met helium (zeer lage
oplosbaarheid in vloeistoffen)
o dit door onder vacuüm te plaatsen, te koken onder reflux of te ontgassen in
het ultrasoon bad (labo)
2. Aan het einde van elke aanzuigleiding filterkorf
o met een porositeit van 5 µm
o om stofdeeltjes tegen te houden dit dient ervoor om de pompkleppen te
beschermen
3. De in gepaste verhouding aangezogen solventen worden na doorgang door de
mengkamer door de hogedrukpomp naar de injector en kolom gestuurd
o Pomp: dient een zo constant mogelijk pulsvrij debiet te leveren (10 µl tot 10
ml/min)
om pulsvrije stroming te bekomen = gebruik maken van 2
alternerende plunjerkoppen (=pomp) dit pompsysteem zorgt voor
een pulsvrije stroom doordat de ene plunjerkop vloeistof (eluens) naar
de kolom stuurt, terwijl de andere eluens aanzuigt
eluensvoorziening
vloeistofreservoirs bevatten de MF die frequent bestaat uit: water, waterige
bufferoplossingen, mengsels van water en organische oplosmiddelen of
