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Labjournaal hCR translocatie celbiologie psychobiologie jaar 1
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Labjournaal hGR translocatie voor het vak celbiologie voor de studie psychobiologie jaar 1.
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Vendeur
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LABJOURNAALCELBIOLOGIE Naam student
Studentnummer
Groep
: Marleen Veldhuis
: 13144537
: P3
Humaan glucocorticoïd receptor translocatie bij 17-AAG in Naam docent : Benjamin Tak
HEK293-cellen Inleverdatum : 15 maart 2021
,Inductie & deductie
woensdag 17 februari 2021 09:00
PCR en Agarose Gelelektroforese (dagdeel 1 + dagdeel 3)
Proefopzet
Doel
PCR: het amplificeren van het hGR cDNA met behulp van PCR.
Agarose Gelelektroforese: de afgeknipte fragmenten scheiden van de gewenste fragmenten.
Dit is om te controleren of de PCR succesvol was, of de restrictiedigesties succesvol waren en
om het DNA-materiaal te zuiveren.
Benodigdheden
PCR:
• dNTPs
• Dream Taq
• T7 forward en T3 reverse primer
• PCR Dream Taq Buffer
• Ouderplasmide pBluescript SK+ met hGR gen (pBS-SK+_hGR)
Agarose Gelelektroforese:
• Agarose
• TAE buffer
• Midori Green
Stappenplan
PCR:
PCR mastermix
Figuur 1: stappenplan PCR.
Uiteindelijke PCR-product: lineair DNA, restrictiesites aan beide uiteinden en hGR.
Voor het exacte protocol verwijs ik naar ExperD (Labbuddy, 2021).
Agarose Gelelektroforese:
Voorbereiding subklonering Pagina 1
,Figuur 2: stappenplan Agarose Gelelektroforese.
Voor het exacte protocol verwijs ik naar ExperD (Labbuddy, 2021).
Controles
PCR:
• Controle met water in plaats van DNA
• Negatieve controle: door een PCR zonder template DNA in te zetten
Agarose Gelelektroforese:
• Restrictieproducten
○ hGR geknipt: is de PCR de juiste lengte?
○ eGFP geknipt
○ Ongeknipt: verschil tussen geknipt en ongeknipt
○ eGFP enkel geknipt (2x): kijken of BAMHI en Xhol werken
Voorspellingen
We verwachten een insert te amplificeren met een grootte van 3242 baseparen (bp).
Bij de negatieve controle verwachten we geen product te zien.
Voorbereiding subklonering Pagina 2
, Figuur 3: Agarose Gelektroforese voorspellingen -> 1 = hGR insert geknipt met
BamHI en XhoI, 2 = eGFP geknipt met BamHI en XhoI, 3 = eGFP geknipt met
BamHI, 4 = eGFP geknipt met XhoI, 5 = ongeknipt hGR-insert, 6 = ongeknipt
eGFP en 7 = de negatieve controle.
Tabel 1: voorspelling groottes (aantal bp) bij de Agarose Gelelektroforese.
PCR opzuiveren, Restrictiedigestie, DNA-extractie en DNA-concentratie
bepalen (dagdeel 2 en dagdeel 3)
Proefopzet
Doel
PCR opzuiveren: het PCR-product opzuiveren met behulp van een spinkolom, zodat er alleen
DNA overblijft.
Restrictiedigestie: compatibele ‘stick ends’ creëren bij het insert (hGR) en de expressieplasmide
(pEGFP-C1 dat green-fluorescent protein (GFP) gen bevat)
DNA-extractie: DNA extraheren.
Benodigdheden
PCR opzuiveren:
Voorbereiding subklonering Pagina 3
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