Methoden: DNA
Belangrijk om ook de slides van methoden 1 over DNA er terug bij te nemen zodat je weet hoe DNA
geëxtraheert, bewaart, gekwantificeerd, geconcentreerd wordt. Ook hoe in vitro DNA gemaakt
wordt, hoe we DNA gaan karakteriseren en manipuleren.
DNA = deoxyribonucleïnezuur, dat bestaat uit een nucleotide: dit bevat
een fosfaat, suiker en een base. 4 verschillende basen mogelijk: adenine,
guanine, thymine en cytosine in DNA. A-T = 2 bindingen. C-G = 3 bindingen.
De fosfodiesterase verbindingen worden gevormd door het 5’ koolstof te
verbinden met een 3’ hydroxyl waar de fosfaatgroep aan hangt.
Er is sprake van deoxyribonucleotides bij DNA, deze stof heeft dus geen
hydroxyl groep meer op het 2’ koolstof. Bij dideoxynucleotiden (gebruikt
bij sanger sequencing – zie verder) is er geen OH groep op de 2’ en op de 3’
positie, waardoor de fosfaatgroep niet kan binden op de OH-3’ en er geen
verdere DNA gemaakt kan worden.
DNA helices hebben een major en een minor groeve, waar probes specifiek
in kunnen binden. Het DNA heeft complementaire strengen die antiparallel
lopen. De nucleotiden vormen een ruggengraat structuur met de basen aan
die verschillend gaan binden door waterstofbindingen. De lengte van een
DNA streng wordt uitgedrukt vaak in bp (baseparen) of in nt (nucleotiden).
Om de richting aan te geven in DNA wordt het volgende gebruikt:
- Upstream = meer in de 5’ richting
- Downstream = meer in de 3’ richting
DNA sequentiebepaling
Bij sequentie gaan we de volgorde van de basen in het DNA gaan aflezen. Ondertussen zijn er al
verschillende methoden om dit te doen.
Toepassingen van sequentiebepaling:
- De novo genoom sequentiebepaling
o Hierbij is er een nieuw species waarbij we de verschillende genen willen sequencen
om het genoom helemaal in kaart te brengen
o Dit is een species waarvan het nog niet gebeurt is: dit kan volledig of gedeeltelijk
o Bv humaan genoom project – een nieuw organisme: SARS-CoV-2
- Resequencing
o Hierbij gaat men sequencing doen bij een bepaald organisme waarvan er al een
referentiegenoom bestaat, en deze vergelijken
o Zo kan men naar verschillen tussen individuen gaan zoeken (SNPs)
o Kan men mutaties zoeken (monogene ziekten)
o Klinische toepassingen:
▪ Diagnose, farmacogenetica, NIPT…
- Sequentiebepaling als een teller
o Aantallen van DNA moleculen gaan bepalen – niet om de sequentie na te gaan
1
,First-generation sequencing
Dit is Sanger sequencing (gezien in methode 1). Dit is sequensen in bulk. Alle losse stukken die een
geheel zijn gaan aflezen en dan heel veel verschillende stukken DNA. We weten dus enkel het
resultaat van het hele geheel van een genoom en niet van individuele cellen.
Chemische klievingsmethode.
Principe = differentiële chemische klieving van
nucleïnezuren in 4 verschillende reacties,
gevolgd door scheiding volgens grootte op gel
en visualisatie via autoradiografie
Nadeel: relatief korte fragmenten, niet
helemaal specifiek → sequentie niet altijd
éénduidig. Het vereist radioactiviteit en het is
heel arbeidsintensief en vraagt veel tijd om
het uit te voeren.
Sanger sequencing = dideoxy-terminatie methode:
- Template/matrijs = klone of een PCRamplicon (primers en
dNTPs afgebroken)
- Polymerase + primer + mengsel van 4dNTPs + ddNTPs (elk
verschillend ddNTP met een verschillende fluorescentie label)
- Reactie (keten) stopt na het inbouwen van een ddNTP
- De juiste verhouding tussen dNTPs en ddNTPs is nodig
- 1 streng per keer wordt afgelezen – 1 primer
- Beperkt tot +- 500 nt, er zijn moeilijkheden met herhalingen
- Voor betrouwbaarheid best 2 aparate reacties om beide
richtingen af te kunnen lezen (FW en RV primer)
- Cappilaire gelelektroforese: kleine fragmenten komen eerst
voorbij de sensor en worden eerst afgelezen, de langste fragmenten worden laatst afgelzen
dus van links naar rechts en van klein naar groot → zo de sequentie kunnen bepalen.
Tegenwoordig kan dit gebeuren zonder radioactiviteit en kan men 96 van die capillairen tegelijk
laten aflezen met behulp van een laser en sensor kan men 5’ → 3’ aflezen.
Het resultaat van een sanger sequentie: de eerste 30 nucleotiden zijn niet betrouwbaar/afleesbaar.
Bij primer ontwikkeling moet men hier rekening mee houden. Er kunnen sequenties van ongeveer
500-700 bp goed afgelezen worden, dit is heel lang. Via bepaalde software kan men een
kwaliteitsscore geven aan lek base.
De pieken hebben verschillende kleuren voor de verschillende nucleotides
en kunnen verschillende piekhoogtes hebben. Het elektroferogram kan
achtergrondsignaal bevatten na inserties/deleties waardoor de sequentie
gemengd is en moeilijk afleesbaar → 2 pieken die overlappen = hetereozygoot.
De Fred score is een kwaliteitsscore die gegeven wordt aan een base bij Sanger. Q = -10log10(P)
P = probibiliteit van foutieve base die is afgelezen.
- Fred score van 10 = 1/10 kans dat er een fout is → 90% kans juist
- Fred score 30 → 1/1000 kans dat het fout is → 99,9% kan juist
2
, Mutatiedetectie
- Moeder heeft een G en vader een A → eind resultaat is
een mix van de 2 → deze 2 nucleotiden gaan over elkaar
heen zitten → heterozygoot
- Als ze van beide ouders dezelfde base overkrijgen is de G
piek dubbel zo groot = homozygoot
- Het is in bulk = nadeel → er is een FW en RV primer nodig
ter bevestiging
Humaan genoom project
Gecombineerde sequentie van mensen die anoniem zijn – 5 tal mensen waarvan de genomen van
deze mensen niet te onderscheiden zijn. De base volgorde voor het maken van dit genoom is gedaan
door de Sanger sequencing → dit was de novo sequencing. Men moest bepalen welk fragment van
het genoom waar terecht moest komen → mapping. Craig Venter was de eerste individuele persoon
waarvan het genoom gesequenced werd.
Het humaan genoom project had een enorme impact:
- Technologische ontwikkeling van sequencing
o Automatisering
▪ Gedaalde kosten per base
▪ Enorme toename in sequentiedata
o Aanpak: bepaalde delen van chromosomen bijna onmogelijk te kloneren
- Grote ontwikkelingen voor bioinformatica
- Visie op delen van data (open science, open data)
- Andere methoden omdat nu de bijna volledige sequentie beschikbaar is, ook de delen die
moeilijker te sequencen zijn
- Biologische kennis
o Sequentie en organisatie van nagenoeg alle humane genen zijn bekend
o Vergelijkinde genomics: inzicht in evolutie, in geconserveerde processen
o Genetische verschillen tussen mensen
Nieuwe uitdagingen
- Volledige sequentie (telomeer tot telomeer)
- Meer genomen sequencen van meerdere species
- Meer individuele humane sequenties
- Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
➔ Enorme mogelijkheden voor precion medicine
o Kennis van DNA volgorde en SNPs → diagnose, prognose en prevantie
o Farmacogenomics: verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen
goed/slecht reageren op geneesmiddelen → enorme impact op de industrie
o Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen (diabetes, kanker…)
o Therapie op maat → bv kanker
o Ethische aspecten (werkgevers, verzekeringsmaatschapijen…)
3
Belangrijk om ook de slides van methoden 1 over DNA er terug bij te nemen zodat je weet hoe DNA
geëxtraheert, bewaart, gekwantificeerd, geconcentreerd wordt. Ook hoe in vitro DNA gemaakt
wordt, hoe we DNA gaan karakteriseren en manipuleren.
DNA = deoxyribonucleïnezuur, dat bestaat uit een nucleotide: dit bevat
een fosfaat, suiker en een base. 4 verschillende basen mogelijk: adenine,
guanine, thymine en cytosine in DNA. A-T = 2 bindingen. C-G = 3 bindingen.
De fosfodiesterase verbindingen worden gevormd door het 5’ koolstof te
verbinden met een 3’ hydroxyl waar de fosfaatgroep aan hangt.
Er is sprake van deoxyribonucleotides bij DNA, deze stof heeft dus geen
hydroxyl groep meer op het 2’ koolstof. Bij dideoxynucleotiden (gebruikt
bij sanger sequencing – zie verder) is er geen OH groep op de 2’ en op de 3’
positie, waardoor de fosfaatgroep niet kan binden op de OH-3’ en er geen
verdere DNA gemaakt kan worden.
DNA helices hebben een major en een minor groeve, waar probes specifiek
in kunnen binden. Het DNA heeft complementaire strengen die antiparallel
lopen. De nucleotiden vormen een ruggengraat structuur met de basen aan
die verschillend gaan binden door waterstofbindingen. De lengte van een
DNA streng wordt uitgedrukt vaak in bp (baseparen) of in nt (nucleotiden).
Om de richting aan te geven in DNA wordt het volgende gebruikt:
- Upstream = meer in de 5’ richting
- Downstream = meer in de 3’ richting
DNA sequentiebepaling
Bij sequentie gaan we de volgorde van de basen in het DNA gaan aflezen. Ondertussen zijn er al
verschillende methoden om dit te doen.
Toepassingen van sequentiebepaling:
- De novo genoom sequentiebepaling
o Hierbij is er een nieuw species waarbij we de verschillende genen willen sequencen
om het genoom helemaal in kaart te brengen
o Dit is een species waarvan het nog niet gebeurt is: dit kan volledig of gedeeltelijk
o Bv humaan genoom project – een nieuw organisme: SARS-CoV-2
- Resequencing
o Hierbij gaat men sequencing doen bij een bepaald organisme waarvan er al een
referentiegenoom bestaat, en deze vergelijken
o Zo kan men naar verschillen tussen individuen gaan zoeken (SNPs)
o Kan men mutaties zoeken (monogene ziekten)
o Klinische toepassingen:
▪ Diagnose, farmacogenetica, NIPT…
- Sequentiebepaling als een teller
o Aantallen van DNA moleculen gaan bepalen – niet om de sequentie na te gaan
1
,First-generation sequencing
Dit is Sanger sequencing (gezien in methode 1). Dit is sequensen in bulk. Alle losse stukken die een
geheel zijn gaan aflezen en dan heel veel verschillende stukken DNA. We weten dus enkel het
resultaat van het hele geheel van een genoom en niet van individuele cellen.
Chemische klievingsmethode.
Principe = differentiële chemische klieving van
nucleïnezuren in 4 verschillende reacties,
gevolgd door scheiding volgens grootte op gel
en visualisatie via autoradiografie
Nadeel: relatief korte fragmenten, niet
helemaal specifiek → sequentie niet altijd
éénduidig. Het vereist radioactiviteit en het is
heel arbeidsintensief en vraagt veel tijd om
het uit te voeren.
Sanger sequencing = dideoxy-terminatie methode:
- Template/matrijs = klone of een PCRamplicon (primers en
dNTPs afgebroken)
- Polymerase + primer + mengsel van 4dNTPs + ddNTPs (elk
verschillend ddNTP met een verschillende fluorescentie label)
- Reactie (keten) stopt na het inbouwen van een ddNTP
- De juiste verhouding tussen dNTPs en ddNTPs is nodig
- 1 streng per keer wordt afgelezen – 1 primer
- Beperkt tot +- 500 nt, er zijn moeilijkheden met herhalingen
- Voor betrouwbaarheid best 2 aparate reacties om beide
richtingen af te kunnen lezen (FW en RV primer)
- Cappilaire gelelektroforese: kleine fragmenten komen eerst
voorbij de sensor en worden eerst afgelezen, de langste fragmenten worden laatst afgelzen
dus van links naar rechts en van klein naar groot → zo de sequentie kunnen bepalen.
Tegenwoordig kan dit gebeuren zonder radioactiviteit en kan men 96 van die capillairen tegelijk
laten aflezen met behulp van een laser en sensor kan men 5’ → 3’ aflezen.
Het resultaat van een sanger sequentie: de eerste 30 nucleotiden zijn niet betrouwbaar/afleesbaar.
Bij primer ontwikkeling moet men hier rekening mee houden. Er kunnen sequenties van ongeveer
500-700 bp goed afgelezen worden, dit is heel lang. Via bepaalde software kan men een
kwaliteitsscore geven aan lek base.
De pieken hebben verschillende kleuren voor de verschillende nucleotides
en kunnen verschillende piekhoogtes hebben. Het elektroferogram kan
achtergrondsignaal bevatten na inserties/deleties waardoor de sequentie
gemengd is en moeilijk afleesbaar → 2 pieken die overlappen = hetereozygoot.
De Fred score is een kwaliteitsscore die gegeven wordt aan een base bij Sanger. Q = -10log10(P)
P = probibiliteit van foutieve base die is afgelezen.
- Fred score van 10 = 1/10 kans dat er een fout is → 90% kans juist
- Fred score 30 → 1/1000 kans dat het fout is → 99,9% kan juist
2
, Mutatiedetectie
- Moeder heeft een G en vader een A → eind resultaat is
een mix van de 2 → deze 2 nucleotiden gaan over elkaar
heen zitten → heterozygoot
- Als ze van beide ouders dezelfde base overkrijgen is de G
piek dubbel zo groot = homozygoot
- Het is in bulk = nadeel → er is een FW en RV primer nodig
ter bevestiging
Humaan genoom project
Gecombineerde sequentie van mensen die anoniem zijn – 5 tal mensen waarvan de genomen van
deze mensen niet te onderscheiden zijn. De base volgorde voor het maken van dit genoom is gedaan
door de Sanger sequencing → dit was de novo sequencing. Men moest bepalen welk fragment van
het genoom waar terecht moest komen → mapping. Craig Venter was de eerste individuele persoon
waarvan het genoom gesequenced werd.
Het humaan genoom project had een enorme impact:
- Technologische ontwikkeling van sequencing
o Automatisering
▪ Gedaalde kosten per base
▪ Enorme toename in sequentiedata
o Aanpak: bepaalde delen van chromosomen bijna onmogelijk te kloneren
- Grote ontwikkelingen voor bioinformatica
- Visie op delen van data (open science, open data)
- Andere methoden omdat nu de bijna volledige sequentie beschikbaar is, ook de delen die
moeilijker te sequencen zijn
- Biologische kennis
o Sequentie en organisatie van nagenoeg alle humane genen zijn bekend
o Vergelijkinde genomics: inzicht in evolutie, in geconserveerde processen
o Genetische verschillen tussen mensen
Nieuwe uitdagingen
- Volledige sequentie (telomeer tot telomeer)
- Meer genomen sequencen van meerdere species
- Meer individuele humane sequenties
- Persoonlijke genoomsequentie van iedereen
➔ Enorme mogelijkheden voor precion medicine
o Kennis van DNA volgorde en SNPs → diagnose, prognose en prevantie
o Farmacogenomics: verklaart waarom en voorspelt of bepaalde individuen
goed/slecht reageren op geneesmiddelen → enorme impact op de industrie
o Inzicht in complexe multifactoriële aandoeningen (diabetes, kanker…)
o Therapie op maat → bv kanker
o Ethische aspecten (werkgevers, verzekeringsmaatschapijen…)
3
