Oefeningen Chromatografie
Oefening 1
Gegeven: een stof S:
- Opgelost in buffer A (12 µg/ml): 500 µl (=6 µg) toevoegen aan een overmaat
matrix: supernatans concentratie is na een tijd: 10 µg/ml.
- Opgelost in buffer B (12 µg/ml): 500 µl (=6 µg) toevoegen aan een overmaat
matrix: supernatans concentratie is na een tijd: 12 µg/ml.
De stof wordt over een kolom (20 cm), gevuld met deze matrix, gelopen waarbij de mobiele fase
buffer B is. Na 14 min. elueert de stof van de kolom.
1. Bepaal de tijd dat deze stof in de stationaire fase doorbrengt wanneer ze wordt gelopen
over dezelfde kolom, echter met buffer A als solvent.
2. Bepaal de vertragingscoëfficiënt R
Het is erg moeilijk het volume of de concentratie van de stationaire liquide fase te kennen (Vs of
Cs). Daarom niet de K waarde berekenen, maar k.
Buffer A:
ms = 1 µg
mm = 5 µg
k(bufferA) = ms/mm = 1/5 = 0,2
Buffer B:
ms = 0 µg
mm = 6 µg
k(bufferB) = ms/mm = 0/6 = 0, maw. de stof bindt niet op de matrix.
Wanneer dus de kolom bij buffer B wordt gelopen, kunnen we de tm waarde bepalen = 14 min.
Nu is
tR (buffer A) = ts(e) + tm = tm (1 + k) = 14 min. (1 + 0,2) = 14.1,2 = 16,8 min.
ts(e) (buffer A) = tR-tm = 2,8 min.
R (buffer A) = tm/tR = 14/16,8 = 0,83
Welk is het elutievolume wanneer deze stof in buffer A wordt gelopen met een debiet van
100µl/min?
Ve = VR – Vm
F = VR/tR of VR = F.tR = 100 . 16,8 µl min/min = 1680 µl
R = Vm/VR of Vm = R . VR = 0,83 . 1680 µl = 1400 µl
Dus Ve = 1680 – 1400 µl = 280 µl
, Oefening 2
We bezitten een kolom die 15 cm lang is. Een stof elueert hiervan na 10 minuten, en de
piekbreedte W bedraagt 40 seconden.
Bereken het aantal theoretische platen en de theoretische plaathoogte van deze kolom onder
deze omstandigheden.
w = 4t of t = w/4 = 10 sec.
L = t . ux = t . L/tr = 10 . 15/10 sec. cm/min. = 10 . 15/600 cm = 0,25 cm
N = L2/L2 = ,25 cm2/cm2 = 225/0,0625 = 3600
N=L/H of H = L/N = 150.000 µm/3600 = 41,67 µm
Oefening 1
Gegeven: een stof S:
- Opgelost in buffer A (12 µg/ml): 500 µl (=6 µg) toevoegen aan een overmaat
matrix: supernatans concentratie is na een tijd: 10 µg/ml.
- Opgelost in buffer B (12 µg/ml): 500 µl (=6 µg) toevoegen aan een overmaat
matrix: supernatans concentratie is na een tijd: 12 µg/ml.
De stof wordt over een kolom (20 cm), gevuld met deze matrix, gelopen waarbij de mobiele fase
buffer B is. Na 14 min. elueert de stof van de kolom.
1. Bepaal de tijd dat deze stof in de stationaire fase doorbrengt wanneer ze wordt gelopen
over dezelfde kolom, echter met buffer A als solvent.
2. Bepaal de vertragingscoëfficiënt R
Het is erg moeilijk het volume of de concentratie van de stationaire liquide fase te kennen (Vs of
Cs). Daarom niet de K waarde berekenen, maar k.
Buffer A:
ms = 1 µg
mm = 5 µg
k(bufferA) = ms/mm = 1/5 = 0,2
Buffer B:
ms = 0 µg
mm = 6 µg
k(bufferB) = ms/mm = 0/6 = 0, maw. de stof bindt niet op de matrix.
Wanneer dus de kolom bij buffer B wordt gelopen, kunnen we de tm waarde bepalen = 14 min.
Nu is
tR (buffer A) = ts(e) + tm = tm (1 + k) = 14 min. (1 + 0,2) = 14.1,2 = 16,8 min.
ts(e) (buffer A) = tR-tm = 2,8 min.
R (buffer A) = tm/tR = 14/16,8 = 0,83
Welk is het elutievolume wanneer deze stof in buffer A wordt gelopen met een debiet van
100µl/min?
Ve = VR – Vm
F = VR/tR of VR = F.tR = 100 . 16,8 µl min/min = 1680 µl
R = Vm/VR of Vm = R . VR = 0,83 . 1680 µl = 1400 µl
Dus Ve = 1680 – 1400 µl = 280 µl
, Oefening 2
We bezitten een kolom die 15 cm lang is. Een stof elueert hiervan na 10 minuten, en de
piekbreedte W bedraagt 40 seconden.
Bereken het aantal theoretische platen en de theoretische plaathoogte van deze kolom onder
deze omstandigheden.
w = 4t of t = w/4 = 10 sec.
L = t . ux = t . L/tr = 10 . 15/10 sec. cm/min. = 10 . 15/600 cm = 0,25 cm
N = L2/L2 = ,25 cm2/cm2 = 225/0,0625 = 3600
N=L/H of H = L/N = 150.000 µm/3600 = 41,67 µm
