Practica immunologie – Theorie
Inhoud
Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen .............................................................. 2
1. De antigeen-antistofbinding ............................................................................... 2
1.1 Antigeen ...................................................................................................... 2
1.2 Antistof ....................................................................................................... 3
1.3 Antistof – antigeen interactie ......................................................................... 3
2. Affiniteit en aviditeit ........................................................................................... 4
2.1 Affiniteit ...................................................................................................... 4
2.2 Aviditeit ....................................................................................................... 5
Hoofdstuk 2: Aantonen van antistoffen ...................................................................... 6
1. Precipitatie ....................................................................................................... 7
1.1 Algemeen principe ....................................................................................... 7
1.2 Precipitatiereacties in gel in afwezigheid van elektroforese ............................. 8
1.3 Precipitatiereacties in gel in aanwezigheid van elektroforese ......................... 10
2. Agglutinatie..................................................................................................... 11
2.1 Algemeen principe ..................................................................................... 11
2.2 Ringagglutinatie: ringtest ............................................................................ 13
2.3 Snelle agglutinatie of draagglas-agglutinatie ................................................ 14
2.4 Trage agglutinatie of buisjes-agglutinatie ..................................................... 15
2.5 Coombs’ test ............................................................................................. 16
2.6 Hemagglutinatie-inhibitie (HI) ..................................................................... 17
3. Neutralisatietest ............................................................................................. 19
4. Complementbindingsreactie ............................................................................ 20
4.1 Complement systeem ................................................................................ 20
4.2 Complementbindingstest ........................................................................... 20
5. Ligandbindingstesten ...................................................................................... 21
5.1 Enzym-immunoassays ............................................................................... 21
5.2 Immunoblotting of Western blotting ............................................................ 29
5.3 Fluorescentie-immunoassay (FIA) ............................................................... 31
Hoofdstuk 3: Evaluatie van aantal en functies van immuuncellen .............................. 33
1. Isolatie van leukocyten (- populaties of subpopulaties) uit bloed of weefsels ....... 33
1
, 1.1 Isolatie op basis van celdensiteit ............................................................... 33
1.2 Isolatie op basis van cellading .................................................................... 35
1.3 Isolatie op basis van fagocyterende eigenschappen ................................... 36
1.4 Isolatie op basis van adhesie ...................................................................... 36
1.5 Isolatie op basis van membraanmerkers .................................................... 36
2. Detectie van immuuncellen ............................................................................. 43
3. Functietesten .................................................................................................. 43
3.1 Functietesten voor lymfocyten ................................................................... 44
3.2 Functietesten voor lymfocyten, monocyten/macrofagen en granulocyten . 47
3.3 Functietesten voor monocyten / macrofagen en granulocyten ................... 52
Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen
1. De antigeen-antistofbinding
1.1 Antigeen
• “vreemd partikel”
• In staat afweerreactie op te wekken
• ≠ epitoop: deel van een macromolecule (antigen) dat herkend kan worden door
antilichamen, B-cellen en T-cellen
• Gebonden door As
• Monovalent <> multivalent Ag
• Monoklonaal <> polyklonaal As
o Monoklonaal = verzameling van As gericht tegen 1 epitoop van hetzelfde
Ag
o Polyklonaal (antiserum) = verzameling van As gericht tegen veschillende
epitopen van hetzelfde Ag
• Kenmerken
o Grootte ↑
o Complexiteit ↑
o Structurele stabiliteit ↑ Immunogeniciteit ↑
o Afbreekbaarheid ↑
o Lichaamsvreemd ↑
2
,1.2 Antistof
• = immunoglobuline
• 2 zware ketens (α, δ, ε, γ, µ)
• Constant en variabel gedeelte
• Antigeenbindingsplaats
• Scharniergebied
• Disulfide bruggen
1.3 Antistof – antigeen interactie
• Basis van de immunochemie
• Dmv zwakke niet-covalente krachten
o Worden belangrijk wanneer Ag en As elkaar dicht benaderen
o Primaire binding Ag-As: zeer snel
o Secundaire binding Ag-As: trager
Primaire binding
• Van der Waals-krachten
o Aantrekkingskracht tussen oscillerende dipolen (afwisselend + en -) in
atomen
o Werkzaam tot afstand 1000 Å
o OE met de 7de macht van de afstand tussen moleculen
o Zwakker dan Coulombse krachten
• Coulombse krachten
o Elektrostatische krachten
o Tegengesteld geladen ionengroepen trekken elkaar aan
o Werkzaam tot afstand 100 Å
o OE met de 2de macht van de afstand tussen moleculen
o Belangrijk in het begin van de binding tussen Ag-As
Secundaire binding
• Waterstofbruggen
o Zwakke & omkeerbare interacties tussen hydrofiele groepen (-OH, -NH2 en
-COOH)
o Minder vlug in een waterig milieu → water neemt deel aan vorming van
waterstofbruggen
o Werkzaam over zeer korte afstand (1-1,5 Å)
o Geringe bijdrage in stabiliteit Ag-As binding
• Apolaire of hydrofobe krachten
o Interacties tussen apolaire groepen
o Werkzaam over korte afstand
o Belangrijk voor de vorming van Ag-As complexen
➔ water wordt uitgedreven
3
, Kost minder energie om Ag-As binding te verhinderen tijdens het proces dan om een
bestaande binding te verbreken
Hoe langer de binding kan plaatsgrijpen, hoe sterker de binding
Evenwichtsreactie
• Ka = reactieconstante bij associatie → snel
• Kd = reactieconstante bij dissociatie → wisselend verloop
2. Affiniteit en aviditeit
2.1 Affiniteit
Definitie
• Vermogen van 1 antistofmolecule om aan 1 epitoop te binden
• = som van alle non-covalente bindingen
Affiniteitsconstante
• Evenwichtsconstante: Ka
• Maat voor affiniteit van een As voor 1 epitoop van een Ag
• Hoge affiniteitsconstante: weinig Ag nodig om 50% van de bindingsplaatsen van
de As te verzadigen
• Zegt niet over de snelheid waarmee de binding gebeurt
• Wordt beïnvloed door:
o Afstand (Å)
o Krachten
o Factoren
▪ pH
• optimaal: 6,5-7
• mAs zijn gevoelig aan pH veranderingen
• pH veranderingen hebben sterke impact op Coulombse
krachten
▪ Ionensterkte
• Zoutconcentratie ↓ → Ka ↑
• Zoutconcentratie ↑
o → Ka ↓ indien binding vooral uit Coulombse krachten
bestaat
o → Ka ↑ indien binding vooral uit hydrofobe bindingen
bestaat
4
, ▪ T°
• T° ↓ → Ka ↑
• Bij sommige immunologische testen: Ag-As herkenning
specifieker wanneer er bij lage T° wordt geïncubeerd (4°C)
▪ Binding Ag aan een vaste fase
• Lokale [Ag] ↑ → ↑ kans dat een As dat loskomt opnieuw zal
binden aan een aangrenzend Ag → ↑ Ka
▪ ↓ oppervlakte spanning
• Toevoegen van detergentia
• Effect op van der Waals krachten
▪ Reactietijd
• Reactietijd ↑ → ↑ van der Waals krachten,
waterstofbruggen, hydrofobe-bindingen
▪ H2O onttrekkende stoffen en niet-ionische polymeren
• Onttrekken deel van water aan Ag- en As-moleculen → Ag-
en As-moleculen worden in een kleiner volume
geconcentreerd → reactiviteit ↑
2.2 Aviditeit
Definitie
• Kracht van de binding tussen As in een antiserum en (multivalente) Ag
Samengesteld effect van:
• Affiniteit
• Aantal bindingsplaatsen (IgM > IgA > IgG)
• Testsysteem: diffuse oplossing vs vaste drager
Aviditeitsconstante voor een polyklonaal serum
• Voegt men een aantal mAs samen dan zal de aviditeit van het polyklonaal serum
groter zijn dan de som van de affiniteiten van de mAs → versterkingseffect van
polyklonaal serum
5
,Hoofdstuk 2: Aantonen van antistoffen
Niet steeds dezelfde antistoffenfracties worden aangetoond
• Precipitatie: IgG, IgM
• Neutralisatietest: IgG, IgM, IgA
• Complementbindingstest: IgG, IgM
Tijdstip van serum verzameling
• Primaire immuunrespons: IgM antistoffen
o Antistoffen gericht tgo immunodominante epitopen
o Antistoffen hebben lage affiniteit, maar hoge aviditeit
• Secundaire immuunrespons: IgG antistoffen
o Antistoffen gericht tgo minder immunodominante epitopen
6
, o Antistoffen hebben hoge affiniteit
Serologische testen → aantonen van As
• Staalname: serum
o Bloed laten stollen – bovenstaande serum afnemen – centrifugeren om
overblijvende RBC te verwijderen
• Correcte bewaring van de stalen: T°, duur, contaminatie
o Natriumazide: lange bewaring van stalen
▪ Inhibitie werking mitochondriën → verstoring energie-metabolisme
▪ Stabiliteit van serum wordt verhoogd
• Keuze van de test is afhankelijk van:
o Gewenste specificiteit (~ vals + resultaten)
o Gewenste sensitiviteit (~ vals – resultaten)
o Eigenschappen van antistoffen
1. Precipitatie
1.1 Algemeen principe
• Aantonen antistoffen (of antigenen) door onoplosbaar immuuncomplex te
genereren tussen Ag en As
• 3 fasen
1. Binding van 1 epitoop aan 1 bindingsplaats As → oplosbaar Ag-As
complex
2. Meerdere primair gevormde complexen → groot IC
3. Groot IC slaat neer → onoplosbaar precipitaat
• Neerslaan gebeurt enkel bij ideale Ag-As verhouding
• Zowel bij overmaat Ag als bij overmaat As → kleine IC’n → geen neerslag (weinig
precipitatie) → vals negatief resultaat = PROZONE EFFECT
7
, • Wanneer een Ag slechts 1 epitoop bezit → geen precipitatie: meerdere As
moeten op 1 Ag kunnen binden om een groot IC te vormen
[As] > ]Ag] Overmaat aan As: geen neerslag Prozone effect
[As] ~ [As] Equivalentiezone (niet=): wel neerslag Precipitatielijn
[As] < [Ag] Overmaat aan Ag: geen neerslag Prozone effect
1.2 Precipitatiereacties in gel in afwezigheid van elektroforese
• Gel: agar in buffer
o Agar: negatieve lading
o Waterige fase: positief geladen
o Wanneer agar stolt → netwerk met poriëngrootte bepaalt door [agar]
▪ Lage [agar] → grote poriën, hoge [agar] → kleine poriën
▪ Kleine moleculen kunnen doorheen de poriën
▪ Grote moleculen (bv.: IC’n) worden vastgehouden in het netwerk
van de gel
a. Dubbele immunodiffusie volgens Ouchterlony
Ag en As in gaatjes in gel
(+) precipitatielijn
Semi-kwantitatieve test
• Agarose-gel (op draagglaasje): gaatjes in gel geponst
• As en Ag aanbrengen in tegenoverliggende gaatjes aan uiteinde
• Spontane diffusie van As en Ag
• [As] en [Ag] zal afnemen naarmate ze verder weg diffunderen in de gel
8
Inhoud
Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen .............................................................. 2
1. De antigeen-antistofbinding ............................................................................... 2
1.1 Antigeen ...................................................................................................... 2
1.2 Antistof ....................................................................................................... 3
1.3 Antistof – antigeen interactie ......................................................................... 3
2. Affiniteit en aviditeit ........................................................................................... 4
2.1 Affiniteit ...................................................................................................... 4
2.2 Aviditeit ....................................................................................................... 5
Hoofdstuk 2: Aantonen van antistoffen ...................................................................... 6
1. Precipitatie ....................................................................................................... 7
1.1 Algemeen principe ....................................................................................... 7
1.2 Precipitatiereacties in gel in afwezigheid van elektroforese ............................. 8
1.3 Precipitatiereacties in gel in aanwezigheid van elektroforese ......................... 10
2. Agglutinatie..................................................................................................... 11
2.1 Algemeen principe ..................................................................................... 11
2.2 Ringagglutinatie: ringtest ............................................................................ 13
2.3 Snelle agglutinatie of draagglas-agglutinatie ................................................ 14
2.4 Trage agglutinatie of buisjes-agglutinatie ..................................................... 15
2.5 Coombs’ test ............................................................................................. 16
2.6 Hemagglutinatie-inhibitie (HI) ..................................................................... 17
3. Neutralisatietest ............................................................................................. 19
4. Complementbindingsreactie ............................................................................ 20
4.1 Complement systeem ................................................................................ 20
4.2 Complementbindingstest ........................................................................... 20
5. Ligandbindingstesten ...................................................................................... 21
5.1 Enzym-immunoassays ............................................................................... 21
5.2 Immunoblotting of Western blotting ............................................................ 29
5.3 Fluorescentie-immunoassay (FIA) ............................................................... 31
Hoofdstuk 3: Evaluatie van aantal en functies van immuuncellen .............................. 33
1. Isolatie van leukocyten (- populaties of subpopulaties) uit bloed of weefsels ....... 33
1
, 1.1 Isolatie op basis van celdensiteit ............................................................... 33
1.2 Isolatie op basis van cellading .................................................................... 35
1.3 Isolatie op basis van fagocyterende eigenschappen ................................... 36
1.4 Isolatie op basis van adhesie ...................................................................... 36
1.5 Isolatie op basis van membraanmerkers .................................................... 36
2. Detectie van immuuncellen ............................................................................. 43
3. Functietesten .................................................................................................. 43
3.1 Functietesten voor lymfocyten ................................................................... 44
3.2 Functietesten voor lymfocyten, monocyten/macrofagen en granulocyten . 47
3.3 Functietesten voor monocyten / macrofagen en granulocyten ................... 52
Hoofdstuk 1: Eigenschappen van antistoffen
1. De antigeen-antistofbinding
1.1 Antigeen
• “vreemd partikel”
• In staat afweerreactie op te wekken
• ≠ epitoop: deel van een macromolecule (antigen) dat herkend kan worden door
antilichamen, B-cellen en T-cellen
• Gebonden door As
• Monovalent <> multivalent Ag
• Monoklonaal <> polyklonaal As
o Monoklonaal = verzameling van As gericht tegen 1 epitoop van hetzelfde
Ag
o Polyklonaal (antiserum) = verzameling van As gericht tegen veschillende
epitopen van hetzelfde Ag
• Kenmerken
o Grootte ↑
o Complexiteit ↑
o Structurele stabiliteit ↑ Immunogeniciteit ↑
o Afbreekbaarheid ↑
o Lichaamsvreemd ↑
2
,1.2 Antistof
• = immunoglobuline
• 2 zware ketens (α, δ, ε, γ, µ)
• Constant en variabel gedeelte
• Antigeenbindingsplaats
• Scharniergebied
• Disulfide bruggen
1.3 Antistof – antigeen interactie
• Basis van de immunochemie
• Dmv zwakke niet-covalente krachten
o Worden belangrijk wanneer Ag en As elkaar dicht benaderen
o Primaire binding Ag-As: zeer snel
o Secundaire binding Ag-As: trager
Primaire binding
• Van der Waals-krachten
o Aantrekkingskracht tussen oscillerende dipolen (afwisselend + en -) in
atomen
o Werkzaam tot afstand 1000 Å
o OE met de 7de macht van de afstand tussen moleculen
o Zwakker dan Coulombse krachten
• Coulombse krachten
o Elektrostatische krachten
o Tegengesteld geladen ionengroepen trekken elkaar aan
o Werkzaam tot afstand 100 Å
o OE met de 2de macht van de afstand tussen moleculen
o Belangrijk in het begin van de binding tussen Ag-As
Secundaire binding
• Waterstofbruggen
o Zwakke & omkeerbare interacties tussen hydrofiele groepen (-OH, -NH2 en
-COOH)
o Minder vlug in een waterig milieu → water neemt deel aan vorming van
waterstofbruggen
o Werkzaam over zeer korte afstand (1-1,5 Å)
o Geringe bijdrage in stabiliteit Ag-As binding
• Apolaire of hydrofobe krachten
o Interacties tussen apolaire groepen
o Werkzaam over korte afstand
o Belangrijk voor de vorming van Ag-As complexen
➔ water wordt uitgedreven
3
, Kost minder energie om Ag-As binding te verhinderen tijdens het proces dan om een
bestaande binding te verbreken
Hoe langer de binding kan plaatsgrijpen, hoe sterker de binding
Evenwichtsreactie
• Ka = reactieconstante bij associatie → snel
• Kd = reactieconstante bij dissociatie → wisselend verloop
2. Affiniteit en aviditeit
2.1 Affiniteit
Definitie
• Vermogen van 1 antistofmolecule om aan 1 epitoop te binden
• = som van alle non-covalente bindingen
Affiniteitsconstante
• Evenwichtsconstante: Ka
• Maat voor affiniteit van een As voor 1 epitoop van een Ag
• Hoge affiniteitsconstante: weinig Ag nodig om 50% van de bindingsplaatsen van
de As te verzadigen
• Zegt niet over de snelheid waarmee de binding gebeurt
• Wordt beïnvloed door:
o Afstand (Å)
o Krachten
o Factoren
▪ pH
• optimaal: 6,5-7
• mAs zijn gevoelig aan pH veranderingen
• pH veranderingen hebben sterke impact op Coulombse
krachten
▪ Ionensterkte
• Zoutconcentratie ↓ → Ka ↑
• Zoutconcentratie ↑
o → Ka ↓ indien binding vooral uit Coulombse krachten
bestaat
o → Ka ↑ indien binding vooral uit hydrofobe bindingen
bestaat
4
, ▪ T°
• T° ↓ → Ka ↑
• Bij sommige immunologische testen: Ag-As herkenning
specifieker wanneer er bij lage T° wordt geïncubeerd (4°C)
▪ Binding Ag aan een vaste fase
• Lokale [Ag] ↑ → ↑ kans dat een As dat loskomt opnieuw zal
binden aan een aangrenzend Ag → ↑ Ka
▪ ↓ oppervlakte spanning
• Toevoegen van detergentia
• Effect op van der Waals krachten
▪ Reactietijd
• Reactietijd ↑ → ↑ van der Waals krachten,
waterstofbruggen, hydrofobe-bindingen
▪ H2O onttrekkende stoffen en niet-ionische polymeren
• Onttrekken deel van water aan Ag- en As-moleculen → Ag-
en As-moleculen worden in een kleiner volume
geconcentreerd → reactiviteit ↑
2.2 Aviditeit
Definitie
• Kracht van de binding tussen As in een antiserum en (multivalente) Ag
Samengesteld effect van:
• Affiniteit
• Aantal bindingsplaatsen (IgM > IgA > IgG)
• Testsysteem: diffuse oplossing vs vaste drager
Aviditeitsconstante voor een polyklonaal serum
• Voegt men een aantal mAs samen dan zal de aviditeit van het polyklonaal serum
groter zijn dan de som van de affiniteiten van de mAs → versterkingseffect van
polyklonaal serum
5
,Hoofdstuk 2: Aantonen van antistoffen
Niet steeds dezelfde antistoffenfracties worden aangetoond
• Precipitatie: IgG, IgM
• Neutralisatietest: IgG, IgM, IgA
• Complementbindingstest: IgG, IgM
Tijdstip van serum verzameling
• Primaire immuunrespons: IgM antistoffen
o Antistoffen gericht tgo immunodominante epitopen
o Antistoffen hebben lage affiniteit, maar hoge aviditeit
• Secundaire immuunrespons: IgG antistoffen
o Antistoffen gericht tgo minder immunodominante epitopen
6
, o Antistoffen hebben hoge affiniteit
Serologische testen → aantonen van As
• Staalname: serum
o Bloed laten stollen – bovenstaande serum afnemen – centrifugeren om
overblijvende RBC te verwijderen
• Correcte bewaring van de stalen: T°, duur, contaminatie
o Natriumazide: lange bewaring van stalen
▪ Inhibitie werking mitochondriën → verstoring energie-metabolisme
▪ Stabiliteit van serum wordt verhoogd
• Keuze van de test is afhankelijk van:
o Gewenste specificiteit (~ vals + resultaten)
o Gewenste sensitiviteit (~ vals – resultaten)
o Eigenschappen van antistoffen
1. Precipitatie
1.1 Algemeen principe
• Aantonen antistoffen (of antigenen) door onoplosbaar immuuncomplex te
genereren tussen Ag en As
• 3 fasen
1. Binding van 1 epitoop aan 1 bindingsplaats As → oplosbaar Ag-As
complex
2. Meerdere primair gevormde complexen → groot IC
3. Groot IC slaat neer → onoplosbaar precipitaat
• Neerslaan gebeurt enkel bij ideale Ag-As verhouding
• Zowel bij overmaat Ag als bij overmaat As → kleine IC’n → geen neerslag (weinig
precipitatie) → vals negatief resultaat = PROZONE EFFECT
7
, • Wanneer een Ag slechts 1 epitoop bezit → geen precipitatie: meerdere As
moeten op 1 Ag kunnen binden om een groot IC te vormen
[As] > ]Ag] Overmaat aan As: geen neerslag Prozone effect
[As] ~ [As] Equivalentiezone (niet=): wel neerslag Precipitatielijn
[As] < [Ag] Overmaat aan Ag: geen neerslag Prozone effect
1.2 Precipitatiereacties in gel in afwezigheid van elektroforese
• Gel: agar in buffer
o Agar: negatieve lading
o Waterige fase: positief geladen
o Wanneer agar stolt → netwerk met poriëngrootte bepaalt door [agar]
▪ Lage [agar] → grote poriën, hoge [agar] → kleine poriën
▪ Kleine moleculen kunnen doorheen de poriën
▪ Grote moleculen (bv.: IC’n) worden vastgehouden in het netwerk
van de gel
a. Dubbele immunodiffusie volgens Ouchterlony
Ag en As in gaatjes in gel
(+) precipitatielijn
Semi-kwantitatieve test
• Agarose-gel (op draagglaasje): gaatjes in gel geponst
• As en Ag aanbrengen in tegenoverliggende gaatjes aan uiteinde
• Spontane diffusie van As en Ag
• [As] en [Ag] zal afnemen naarmate ze verder weg diffunderen in de gel
8
