Les 5A: Bacteriële sequencing
Terminologie
- Next generation sequencing (NGS)
o High throughput genome sequencing technologieën
o Miljoenen reads tegelijkertijd bekijken
- Whole genome sequencing
o Sequencing van het volledige genoom van een organisme
- Amplicon sequencing
o Een targeted NGS-methode
o Specifieke genoomregio’s worden geamplificeerd door polymerase
kettingreactie (PCR)
o Kan door verschillende technologieën
- Metagenomic sequencing
o NGS-methode om het volledige genetische materiaal (RNA en DNA) direct in
het staal te detecteren
o = shotgun metagenomic sequencing
- Sequencing read
o Een sequentie van nucleotiden (A, T, C, G) van DNA of RNA
o Paired-end read:
▪ Sequencing vanaf beide uiteinden van een DNA-fragment
• Resulteert in 2 reads per fragment (forward & reserve)
• Verbetert de alignment en reconstructie van repititieve regio’s
o Single-end read:
▪ Sequencing vanaf slechts 1 uiteinde van een DNA-fragment
o Short read: reads met een lengte van typisch een aantal honderd baseparen
o Long read: reads met een lengte van duizenden tot miljoenen baseparen lang
- Library preparation
o Het proces waarbij DNA of RNA stalen worden voorbereid voor sequencing
door het toevoegen van gespecialiseerde adapters en barcodes en
multiplexing van staal
Sequencing workflow
- Stap 1: monstercollectie
o Verzameling van biologisch materiaal (bv bloed, weefsel, bacteriecultuur)
- Stap 2: DNA-extractie
o Isolatie van het DNA uit het monster
- Stap 3: DNA concentratie bepaling en library prep
o Qubit voor bepaling voor de hoeveelheid dubbelstrengig DNA en
voorbereiden van DNA voor sequencing reactie
▪ Bv toevoegen van adaptors, barcodes, normalisatie van hoeveelheid
DNA uit verschillende stalen
▪ Barcodes zodat we verschillende stalen kunnen samenpoolen
1
, o Stap 4: sequencing
▪ Het bepalen van de volgorde van nucleotiden (A, T, C, G) in het DNA
mbv short-read (single of paired end) of long-read sequencing
technologie
o Stap 5: Data-analyse
▪ Interpretatie van sequentiegegevens om genetische variaties en
kenmerken te identificeren
o Stap 6: Data integratie, interpretatie, rapportering
Componenten nodig voor de implementatie van sequencing technologieën
Selectie van Next Generation Sequencing technologie
- De selectie van de meest geschikte platform is essentieel en hangt af van het
doel/onderzoeksvraag
o Wat zit in mijn staal? Lengte van DNA? DNA concentratie? Clean-up nodig?
▪ Zit er veel humaan DNA in waarin we niet geïnteresseerd zijn
o Library prep kits beschikbaar?
o Diepte van sequencing nodig?
o Throughput (= hoeveelheid data gegenereerd per sequencing run) nodig?
o Occasionele of frequente sequencing runs?
o TAT?
o Budget?
o Downstream toepassingen en data analyse?
2
,Sanger sequencing
NGS-technologieën
Short-read sequencing
Long-read sequencing
- Geen PCR-stap nodig want DNA/RNA gaat meteen door de porie
3
, - Wanneer zijn lange reads belangrijk?
o Verbeterende assembly van chromosomen en plasmide
o Short read assembly: heel chaotisch, niet 1 chromosoom kunnen teug maken
o Hybrid assempbly: zowel het gebruik van short als long-reads
▪ Hieruit wel een mooi chromosoom maken
o Vooral in de repetitieve regio’s is het heel moeilijk voor de algoritmes om te
weten wat de juiste positie was
Toepassingen en voorbeelden
Sequencing technieken in de microbiologie
- Whole genome sequencing (WGS)
- Targeted sequencing
o Amplicon sequecing
o Probe enrichment
o Adaptive sequecing
- Shotgun metagenomic sequencing
Whole genome sequencing
- = het proce scan het sequencen en
assembleren van het microbiële
genoom van een organisme
4
Terminologie
- Next generation sequencing (NGS)
o High throughput genome sequencing technologieën
o Miljoenen reads tegelijkertijd bekijken
- Whole genome sequencing
o Sequencing van het volledige genoom van een organisme
- Amplicon sequencing
o Een targeted NGS-methode
o Specifieke genoomregio’s worden geamplificeerd door polymerase
kettingreactie (PCR)
o Kan door verschillende technologieën
- Metagenomic sequencing
o NGS-methode om het volledige genetische materiaal (RNA en DNA) direct in
het staal te detecteren
o = shotgun metagenomic sequencing
- Sequencing read
o Een sequentie van nucleotiden (A, T, C, G) van DNA of RNA
o Paired-end read:
▪ Sequencing vanaf beide uiteinden van een DNA-fragment
• Resulteert in 2 reads per fragment (forward & reserve)
• Verbetert de alignment en reconstructie van repititieve regio’s
o Single-end read:
▪ Sequencing vanaf slechts 1 uiteinde van een DNA-fragment
o Short read: reads met een lengte van typisch een aantal honderd baseparen
o Long read: reads met een lengte van duizenden tot miljoenen baseparen lang
- Library preparation
o Het proces waarbij DNA of RNA stalen worden voorbereid voor sequencing
door het toevoegen van gespecialiseerde adapters en barcodes en
multiplexing van staal
Sequencing workflow
- Stap 1: monstercollectie
o Verzameling van biologisch materiaal (bv bloed, weefsel, bacteriecultuur)
- Stap 2: DNA-extractie
o Isolatie van het DNA uit het monster
- Stap 3: DNA concentratie bepaling en library prep
o Qubit voor bepaling voor de hoeveelheid dubbelstrengig DNA en
voorbereiden van DNA voor sequencing reactie
▪ Bv toevoegen van adaptors, barcodes, normalisatie van hoeveelheid
DNA uit verschillende stalen
▪ Barcodes zodat we verschillende stalen kunnen samenpoolen
1
, o Stap 4: sequencing
▪ Het bepalen van de volgorde van nucleotiden (A, T, C, G) in het DNA
mbv short-read (single of paired end) of long-read sequencing
technologie
o Stap 5: Data-analyse
▪ Interpretatie van sequentiegegevens om genetische variaties en
kenmerken te identificeren
o Stap 6: Data integratie, interpretatie, rapportering
Componenten nodig voor de implementatie van sequencing technologieën
Selectie van Next Generation Sequencing technologie
- De selectie van de meest geschikte platform is essentieel en hangt af van het
doel/onderzoeksvraag
o Wat zit in mijn staal? Lengte van DNA? DNA concentratie? Clean-up nodig?
▪ Zit er veel humaan DNA in waarin we niet geïnteresseerd zijn
o Library prep kits beschikbaar?
o Diepte van sequencing nodig?
o Throughput (= hoeveelheid data gegenereerd per sequencing run) nodig?
o Occasionele of frequente sequencing runs?
o TAT?
o Budget?
o Downstream toepassingen en data analyse?
2
,Sanger sequencing
NGS-technologieën
Short-read sequencing
Long-read sequencing
- Geen PCR-stap nodig want DNA/RNA gaat meteen door de porie
3
, - Wanneer zijn lange reads belangrijk?
o Verbeterende assembly van chromosomen en plasmide
o Short read assembly: heel chaotisch, niet 1 chromosoom kunnen teug maken
o Hybrid assempbly: zowel het gebruik van short als long-reads
▪ Hieruit wel een mooi chromosoom maken
o Vooral in de repetitieve regio’s is het heel moeilijk voor de algoritmes om te
weten wat de juiste positie was
Toepassingen en voorbeelden
Sequencing technieken in de microbiologie
- Whole genome sequencing (WGS)
- Targeted sequencing
o Amplicon sequecing
o Probe enrichment
o Adaptive sequecing
- Shotgun metagenomic sequencing
Whole genome sequencing
- = het proce scan het sequencen en
assembleren van het microbiële
genoom van een organisme
4
