Hoofdstuk 1: basisbegrippen van erfelijkheid
DNA
Opbouw
- Genetisch materiaal bestaat uit:
o DNA = polymeer van nucleotiden
o Aan een C hangt ofwel een purine( A en G), of een pyrimidene (T en C)
- Polynucleotide ketens
o 5’ -3’ fosfaatester bindingen
o 50 – 250 miljoen nucleotide ketens → gecondenseerd tot chromosomen
o 16.600 circulaire nucleotide ketens → mitochondriaal DNA
- Bestaat uit een dubbele helix:
o 2 polynucleotideketens die in tegengestelde richting lopen
o Bij elkaar gehouden door H-bruggen
- De complementariteit is belangrijk voor DNA-replicatie & herstel
o Kennis vd nucleotide sequentie op 1 streng laat toe seq vd andere te bepalen
1ste belangrijk jaar voor DNA onderzoek: 1956
- Normale humane cel heeft 46 chromosomen
- Toont eerst correlatie tussen genotype en fenotype
- Afwijkingen in de genen, kunnen leiden tot aberrante fenotype:
o Down (T21) = 47 chromosomen, leefbaar
o Syndroom van Edwards (T18) = kort leefbaar
o Syndroom van patau (T13) = kort leefbaar
Totale humane genoom in kaart brengen
Belangrijk omdat kennis over chromosomen, genen en de ontwikkeling & groei daarvan, meer info kan geven over ziektes
1975: Sanger sequencing (= chain-terminator methode)
- DNA-duplicatie → Een enkelstrengs DNA-molecuul wordt als template gebruikt
- Toevoeging van primers → Een korte primer hecht zich aan het DNA om de synthese
te starten en vervolgens ingrediënten toevoegen om te gaan sequenteren
- DNA-synthese met dNTP’s en ddNTP’s:
o Normale nucleotiden (dNTP’s, c: 1:100) verlengen de streng.
o Gemerkte dideoxynucleotiden (ddNTP’s) stoppen de synthese op willekeurige
punten
▪ C3 heeft H-groep ipv OH → volgende base kan niet inbouwen → vormt een fosfordiesterbinding
▪ De volgende streng maken ze steeds 1 nucelotide langer
▪ Heeft telkens een specifieke kleur & fix 5’ uiteinde
- Scheiding via capillaire elektroforese → De verschillende fragmenten worden op grootte gescheiden
- Detectie en uitlezen van de volgorde → De labels op ddNTP’s worden uitgelezen, wat de volgorde van het DNA bepaalt
1
,Human reference genome (N > 1)
- = boek van het volledige humane genoom door het “international human genome project”
- Maar de functies vd genen weten we nog niet, daarvoor moeten we:
o Moeten DNA & RNA gaan sequenceren
o Sequenties bepalen & genen identificeren → om een functie te koppelen
o → tegenwoordig kan dit met sterke computers, die het razendsnel doen
Humane genetische variatie in kaart brengen
- = sleutel tot begrijpen vd verschillen tussen mensen & identificeren van genen / varianten die een rol spelen bij ziektes
- Enkele gevonden vb zijn:
o Single nucleotide varianten
o Kleine inserties & deleties
o Kopij nummer variatie
o Structurele variaties → deleties, inserties, translocatie, …
Het humane genoom
- Slechts 5% van onze genen zijn evolutionair bewaard gebleven → zeer belangrijk
o 1% is proteine coderend, sommige naar andere RNA
- In het mitochondriaal genoom is 98% zeer goed bewaard
- Resterende zijn:
o Transposons = belangrijke herhalingen voor functies (zie verder?)
o Heterochromatiden = sequenties op telomeren & centromeren
- DNA:
o 46 lineaire chromosomen
o 22 paar autosomen + 2 seks chr (X en Y)
o Ong 3,1 x 10^9 bp: 24 chr
o Ong 21 000 proteïne coderende genen
o Ong 22 000 RNA-genen
- Mitochrondriaal DNA (enkel maternaal overgeërfd)
o Circulair
o 16.6 x 10^3 bp
o 37 genen (13 proteïne coderend; 22 tRNA; 2 rRNA genen
Gen structuur
Genexpressie
- Gekleurde boxen zijn exonen (= vertaalde sequenties), maar ook niet-
coderende sequenties (= introns)
- Coding strand → complementair aan de strengt dat vertaald gaat worden
(= noncoding strand)
- Bij / voor transport:
o Toevoegen van een 5’ cap en AAA staart → RNA beschermen, rol in
splicing, vertaling en transport
2
,Splicing
- = proces waar de intronen uit het pre-mRNA-molecuul worden verwijderd, en de exonen terug aan elkaar geplakt
- Gebeurt op specifieke herkenningsplaatsen
o Splice donor site (5’) → begin vh intron, start meestal sequentie met GT of GU
o Branch site
▪ binnen het intron, dicht bij acceptor
▪ bevat Adenine → essentieel voor vorming splicing lus of lariat
▪ aangevallen door 5’ uiteinde vh intron
o splice acceptor site → einde vh intron, Meestal AG
- 3 hoofdreacties:
o Knip bij de splice donor
▪ 5’ wordt gekinpt bij de GU
▪ Vrije 5’ bindt aan A in branch site (= nucelofiele aanval) →
vorming lariat
o Knip bij de splice acceptor site
▪ 3’-kant van het intron wordt geknipt bij de AG-sequentie
▪ Intron komt volledig vrij
▪ Lariat structuur blijft over
o Exonen worden samengevoegd
▪ 2 exonen aan elkaar geligeerd
▪ Rijpe mRNA klaar voor translatie
Genetische code en translatie
- Translatie werking:
o Initiatie: Het ribosoom bindt aan het startcodon (AUG - meth) → reading frame wordt bepaald
o Elongatie: tRNA’s brengen aminozuren naar de A-site, en een peptidebinding wordt gevormd
o Translocatie: Het ribosoom schuift op, en de volgende aminozuren worden gekoppeld
o Terminatie: Wanneer een stopcodon bereikt wordt, stopt de eiwitsynthese
o Transfer RNA met zijn anticodon gaan de sequentie herkennen en brengt de
eerste metioniemen met zich mee
▪ Ribosoom en polypeptide binding worden opgebouwd
o 64 (4^3) mogelijke codons (set van 3 basen), 20 verschillende eiwitten →
verschillende codons kunnen tot hetzelfde eiwit leiden
3
,Mutaties – effect van mutaties
Inleiding
- Al hetgeen wat we waarnemen postnataal is wat er gebeurd bij de embryonale fase
- Genetische variatie wordt veroorzaakt door wijzingen in de base sequentie:
o Wijzingen die het aantal nucleotiden niet veranderen
▪ Single nucleotide variant
▪ Gebalanceerde structurele variant
o Wijzingen in het kopijaantal van nucleotiden
▪ Eenvoudige deleties / inserties
▪ Wijzingen in kopijaantal van repitieve sequenites en/of volledige chromosomen
DNA varianten, polymorfismen & populatie genomica
- DNA varianten = alternatieve vormen van DNA door een mutatie
- Op basis van grootschalige genoomsequentie → klassen definiëren
Vroeger Jargon in de kliniek nu Momenteel
• Polymorfisme • Polymorfisme • Common DNA variant
− Variant met frequentie van − Variant dat veroorzaakt geen − >0,05
>0,01 in de populatie ziekte • Lage frequentie DNA variant
• Zeldzame • Mutatie − 0,005-0,05
− “ >0,01 in de populatie − “ Veroorzaakt ziekte - Zeldzame DNA variant
• Common SNP − Frequentie <0,005
− “ >0,05
Deze in de toekomst gebruiken
Waarden arbitrair gekozen
- Door de komst van next-generation sequencing (NGS) methodes kunnen we nu populatie-gebaseerde genoomsequencing
o Omstreekts 2008: ‘1000 genomes project’ → identificeren van genetische variatie in 26 versch populaties
o jargon:
▪ Veranderingen van 1-50 nucleotiden = kleinschalig
▪ Grotere + 50 nucleotiden = structurele variatie
Kleinschalige variaties & structurele variaties
Belangrijkste voorbeelden:
- substitutie = nucleotide veranderd in een ander
- deletie = 1 of meer nucleotide verdwijnt
- inversie = evenveel terug als verwijderd, maar gedraaid (vb: CTCGA – TCGAG)
- duplicatie = insertie op 3’ plek van de gekopieerde sequentie
- insertie = 1 of 2 nucleotides toegevoegd & zijn GEEN kopies van een 5’ aangrenzende seq
- conversie = type van insertie / deletie met een gelijkend stukje verderop of eerder in het gen
- deletion/insertion = verandering van 1 of meer nucleotide, waarbij hij vervangd wordt maar zonder gebruik van inversie,
deletie of conversion
4
,kleine deleties en inserties
- single nucleotide varianten (SNV’s) = basesubstiuties en zijn de meest voorkomende puntmutaties
o transities → verandering blijft binnen eenzelfde base (vb: purine)
o transversies → verandering kan van purine – pyrimidine en visa versa
- transities zijn meer frequent:
o doordat het gedomineerd wordt door C-T conversies / mutaties
o gevoelig want de C gaat snel kunnen veranderen / gemuteerd worden en dan lijkend op een T
- kleine inserties & deleties ontstaan vaak door replicatiefouten
o term indel = omschrijft alle typen DNA-veranderingen die een grootteverandering veroorzaken
o bij ‘1000 GP’ werd het gebruikt om kleine inserties / deleties < 50 nucleotiden
Verschillende regio’s en DNA sequenties in het humane genoom hebben verschillende mutatie frequenties
- Vb: mitochrochrondriaal DNA heeft een hogere mutatie frequentie den nucleair
- Open chromatine wordt eerder gerepliceerd dan gebieden van gecondenceerd chromatine
o Open chromatine is meer toegankelijker
o Gecondenseerd “ repliceert veel later & minder toegankelijker → minder tijd en moeilijker om fouten te corrigeren
- Functionele DNA-sequentie zijn onderhevig aan natuurlijke selectie
o Selectiedruk → als de mutatie nadelig is gaan ze verdwijnen
Soorten substituties
- Silent = AZ blijft hetzelfde en zal weinig effect hebben
- Missense = een ander AZ gaat vormen, kan voordelig of nadelig zijn
- Nonsense = stopcodon komt eerder voor, AZ verliest functie
o Chain termination mutation (kijk na indien belangrijk?)
- Splice mutatie = donor of acceptor muteert, gaat exons skippen of een andere zwakkere acceptor / donor gaat gebruiken
o kan leesraam veranderen, prematuur stopcodon, …
Dynamische mutaties
- een typische mutatie frequentie voor een microsateliet is ongeveer 10 4 per locus per generatie
o microsatelliet = 2 – 6 basenparen die herhaald
worden
o hoge freq vaak door een replicatie slippage = bij
DNA-replicatie kan het terug- of vooruitspringen, en
weer verder repliceren
- wanneer een drempelwaarde van herhalingen wordt overgeschreden binnen één gen → microsatellieten instabieler →
resulteer in dynamische mutatie:
o premutatie = regio / lengte waarin de herhaling nog niet groot genoeg is om zelf ziekte te veroorzaken, maar kan
onstabiel worden bij gametogense (= bij kind)
o anticipatie = symptomen vd ziekte heeft de neiging steeds erger te worden in opeenvolgende generaties (= doordat
het telkens verlengd wordt)
5
, - 3 mechanismen waardoor een dynamische mutatie pathogeen kan zijn / worden:
o Loss of function = exon niet meer tot transcriptie
o Gain of function = exon verlengt met CTG
o Gain of function = hetzelfde, maar kan toxisch zijn
Structurele variatie
= zijn grotere variaties, opverdeeld in:
- Gebalanceerd → geen winst of verlies
o Inversies, translocaties (geen winst of verlies, tenzij op breukpunt) en kopienummervarianten (>50 nucleotiden)
o Kan nogsteeds tot een effect lijden, zelfs desastrueus
- Variatie → Winst of Verlies
o Genetische variatie kan leiden tot zowel winst (gain) als verlies (loss) van genetisch materiaal, wat invloed heeft op
de functie van een gen.
o Insertie & Deletie (Indels)
▪ Insertie: Extra DNA-basen worden toegevoegd
▪ Deletie: DNA-basen gaan verloren
• Bv Velocardiofaciaal syndroom: microdeletie in chr 22q11
▪ Beide kunnen invloed hebben op de genfunctie en eiwitten
o CNV’s (copy number variations)
▪ Dit zijn grote DNA-segmenten (≥1 kb) die in variabel aantal kopieën in het genoom voorkomen
▪ Kan leiden tot winst (duplicatie) of verlies (deletie) van genetisch materiaal
▪ CNV’s kunnen functioneel neutraal zijn of invloed hebben op eigenschappen zoals metabolisme of
Ziektegevoeligheid
o Multiallelisch → variabel kopij-aantal
▪ Multiallelisch betekent dat er meer dan twee verschillende versies (allelen) vh het aantal kopieen van een
genetische locus in de populatie bestaan
▪ Verklaard waarom er interindividuele variatie is → dus hoe snel je bv een medicijn opneemt of voedsel
(On)gebalanceerde structurele varianten
- Ongebalanceerde structurele varianten
o Deletie/duplicatie van een deel van een gen, een volledig gen of meerdere genen (contiguous gene syndrome)
- Gebalanceerde structurele varianten
o Inversies, tranlocaties (onderbroken gen, onder controle van nieuwe
genregulatorische elementen, fusiegen,…)
- Andere structurene varianten
o Insertie-mutatie door retrotranspositie (bv L1-element-LINE)
6
, - Transposon-afgeleide herhalingen (mobiele genetische elementen die zich kunnen verplaatsen binnen het genoom en
soms worden gerepliceerd, waardoor ze als herhaalde sequenties achterblijven) zijn een belangrijk onderdeel van het
humane genoom en ontstonden voornamelijk door retrotranspositie
o 40-50% van het menselijk genoom
o Sommige spelen een rol in evolutionaire innovatie en genexpressie
Retrotransposons: de line-1 familie
- Spelen een belangrijke rol bij de retrotranspositie van LINEs,
SINEs, mRNAs en retrogenen → kan leiden tot vorming processes
psuedogenes
o De L1-elemnten zijn retrotransposons, ze odnergaan
transcriptie naar mRNA
o Dit mRNA verhuist naar cytoplasma en vertaald naar 2
eiwitten = endonuclease & reverse transcriptase
o ze zijn een COPY-PASTE mechanisme = het origineel blijdt bestaan en kan verder migerren
o SINE’s en mRNA hebben zelf geen enzymen, liften zij mee op de endonuclease & reverse T, om zichzelf ergens
anders op het genoom te kopiëren → kan leiden tot inactiectieve processed pseudogeen
- Belangrijke kenmerken:
o Integratie gebeurt vaak in AT-rijke regio’s (TTTT/A- motief).
o Slechts 1 op de 100 volledige L1-elementen (ongeveer 6000 van de 60.000) is nog actief.
o De meeste ingebouwde producten zijn korter en vaak inactief (processed pseudogenes)
Whole-genome sequencing
Hierdoor is een directe meting vd mutatiesnelheid in de kiemlijn mogelijk
Ieder van ons vertoont DNA-varianten niet aanwezig in onze biologische ouders = novo-mutaties
- Gemiddelde aantal bij een kind is ong 60 – 70
- Aantal afhankelijk vd leeftijd vd vader, en in mindere mate van maternale leeftijd
- Kinderen met een oudere vader hebben meer mutaties → door spermatogenese is er veel herhalende meiose en mitose
Hoe gelijkaardig zijn humane genomen?
- Van alle menselijke DNA-varianten zijn:
o SNV’s omvatten 87%
o Indels 13%
o Structurele varianten ong 0,05%
- Hoewel SNV’s en korte indels samen goed zijn voor 99,95% van aantal genetische varianten, valt de grote meerderheid
buiten het coderende DNA & andere belangrijke sequenties → neutrale mutaties vertegenwoordigen
7
, - Als we van ieder van ons een DNA seq opstellen & vergelijken met een
referentiegenoom → 4 tot 5 miljoen genetische varianten, meerderheid
zijn neutraal zoals gezegd
o Afh van plaats, afrikanen hebben meer mutaties
- Structurele varianten betreft 0,05%, maar sommige daarvan zijn zeer groot &
sterker gecorreleerd met functionele DNA- sequenties.
o Dragen meer bij aan veranderende genexpressie, fenotype’s en ziek
Effect van mutaties
Alles kan verklaard worden met win of verlies van functie
- Mutaties kunnen op verschillende manieren optreden:
o In de coderende regio
o In RNA verwerking
o In genregulatie of dosering → beïnvloedt hoeveel wordt geproduceerd & waar
- effecten van mutaties:
o loss of function, gain of function, …
o novel property → eiwit vertoont een nieuwe eigenschap
o foute expressie (op het verkeerde moment of cellen)
Haplo-insufficientie
- = oorzaak van een genetische ziekte waarbij de contributie van een normaal allel onvoldoende is om de ziekte te vermijden
door een loss-of-function vh andere allel
- CHARGE-syndroom:
o CHD7 mutaties → DNA chromatine structuur & genexpressie in vroege embryogenese
o Meerdere congenitale afwijkingen:
▪ Coloboma
▪ Hartdefecten
▪ Atresia van de choana
▪ Retardatie van groei en ontwikkeling
▪ Genitale afwijkingen
▪ ‘Ear’ – Oorafwijkingen
o Neurocristopathie → afwijkingen ivm neurale lijst cellen
- dominant negatief effect (= mutatie verhindert ook resterende normale allel in functie)
o Vb: Osteogenesis imperfecta
▪ Collageen type I is belangrijk voor ontwikkeling vd botten → COL1A1 & COL1A2
nodig voor type I vorming
▪ Bij Haplo-insufficientie → 1 allel van COL1A1 verliest zijn functie → te weinig
procollageen productie = milde OI
8
DNA
Opbouw
- Genetisch materiaal bestaat uit:
o DNA = polymeer van nucleotiden
o Aan een C hangt ofwel een purine( A en G), of een pyrimidene (T en C)
- Polynucleotide ketens
o 5’ -3’ fosfaatester bindingen
o 50 – 250 miljoen nucleotide ketens → gecondenseerd tot chromosomen
o 16.600 circulaire nucleotide ketens → mitochondriaal DNA
- Bestaat uit een dubbele helix:
o 2 polynucleotideketens die in tegengestelde richting lopen
o Bij elkaar gehouden door H-bruggen
- De complementariteit is belangrijk voor DNA-replicatie & herstel
o Kennis vd nucleotide sequentie op 1 streng laat toe seq vd andere te bepalen
1ste belangrijk jaar voor DNA onderzoek: 1956
- Normale humane cel heeft 46 chromosomen
- Toont eerst correlatie tussen genotype en fenotype
- Afwijkingen in de genen, kunnen leiden tot aberrante fenotype:
o Down (T21) = 47 chromosomen, leefbaar
o Syndroom van Edwards (T18) = kort leefbaar
o Syndroom van patau (T13) = kort leefbaar
Totale humane genoom in kaart brengen
Belangrijk omdat kennis over chromosomen, genen en de ontwikkeling & groei daarvan, meer info kan geven over ziektes
1975: Sanger sequencing (= chain-terminator methode)
- DNA-duplicatie → Een enkelstrengs DNA-molecuul wordt als template gebruikt
- Toevoeging van primers → Een korte primer hecht zich aan het DNA om de synthese
te starten en vervolgens ingrediënten toevoegen om te gaan sequenteren
- DNA-synthese met dNTP’s en ddNTP’s:
o Normale nucleotiden (dNTP’s, c: 1:100) verlengen de streng.
o Gemerkte dideoxynucleotiden (ddNTP’s) stoppen de synthese op willekeurige
punten
▪ C3 heeft H-groep ipv OH → volgende base kan niet inbouwen → vormt een fosfordiesterbinding
▪ De volgende streng maken ze steeds 1 nucelotide langer
▪ Heeft telkens een specifieke kleur & fix 5’ uiteinde
- Scheiding via capillaire elektroforese → De verschillende fragmenten worden op grootte gescheiden
- Detectie en uitlezen van de volgorde → De labels op ddNTP’s worden uitgelezen, wat de volgorde van het DNA bepaalt
1
,Human reference genome (N > 1)
- = boek van het volledige humane genoom door het “international human genome project”
- Maar de functies vd genen weten we nog niet, daarvoor moeten we:
o Moeten DNA & RNA gaan sequenceren
o Sequenties bepalen & genen identificeren → om een functie te koppelen
o → tegenwoordig kan dit met sterke computers, die het razendsnel doen
Humane genetische variatie in kaart brengen
- = sleutel tot begrijpen vd verschillen tussen mensen & identificeren van genen / varianten die een rol spelen bij ziektes
- Enkele gevonden vb zijn:
o Single nucleotide varianten
o Kleine inserties & deleties
o Kopij nummer variatie
o Structurele variaties → deleties, inserties, translocatie, …
Het humane genoom
- Slechts 5% van onze genen zijn evolutionair bewaard gebleven → zeer belangrijk
o 1% is proteine coderend, sommige naar andere RNA
- In het mitochondriaal genoom is 98% zeer goed bewaard
- Resterende zijn:
o Transposons = belangrijke herhalingen voor functies (zie verder?)
o Heterochromatiden = sequenties op telomeren & centromeren
- DNA:
o 46 lineaire chromosomen
o 22 paar autosomen + 2 seks chr (X en Y)
o Ong 3,1 x 10^9 bp: 24 chr
o Ong 21 000 proteïne coderende genen
o Ong 22 000 RNA-genen
- Mitochrondriaal DNA (enkel maternaal overgeërfd)
o Circulair
o 16.6 x 10^3 bp
o 37 genen (13 proteïne coderend; 22 tRNA; 2 rRNA genen
Gen structuur
Genexpressie
- Gekleurde boxen zijn exonen (= vertaalde sequenties), maar ook niet-
coderende sequenties (= introns)
- Coding strand → complementair aan de strengt dat vertaald gaat worden
(= noncoding strand)
- Bij / voor transport:
o Toevoegen van een 5’ cap en AAA staart → RNA beschermen, rol in
splicing, vertaling en transport
2
,Splicing
- = proces waar de intronen uit het pre-mRNA-molecuul worden verwijderd, en de exonen terug aan elkaar geplakt
- Gebeurt op specifieke herkenningsplaatsen
o Splice donor site (5’) → begin vh intron, start meestal sequentie met GT of GU
o Branch site
▪ binnen het intron, dicht bij acceptor
▪ bevat Adenine → essentieel voor vorming splicing lus of lariat
▪ aangevallen door 5’ uiteinde vh intron
o splice acceptor site → einde vh intron, Meestal AG
- 3 hoofdreacties:
o Knip bij de splice donor
▪ 5’ wordt gekinpt bij de GU
▪ Vrije 5’ bindt aan A in branch site (= nucelofiele aanval) →
vorming lariat
o Knip bij de splice acceptor site
▪ 3’-kant van het intron wordt geknipt bij de AG-sequentie
▪ Intron komt volledig vrij
▪ Lariat structuur blijft over
o Exonen worden samengevoegd
▪ 2 exonen aan elkaar geligeerd
▪ Rijpe mRNA klaar voor translatie
Genetische code en translatie
- Translatie werking:
o Initiatie: Het ribosoom bindt aan het startcodon (AUG - meth) → reading frame wordt bepaald
o Elongatie: tRNA’s brengen aminozuren naar de A-site, en een peptidebinding wordt gevormd
o Translocatie: Het ribosoom schuift op, en de volgende aminozuren worden gekoppeld
o Terminatie: Wanneer een stopcodon bereikt wordt, stopt de eiwitsynthese
o Transfer RNA met zijn anticodon gaan de sequentie herkennen en brengt de
eerste metioniemen met zich mee
▪ Ribosoom en polypeptide binding worden opgebouwd
o 64 (4^3) mogelijke codons (set van 3 basen), 20 verschillende eiwitten →
verschillende codons kunnen tot hetzelfde eiwit leiden
3
,Mutaties – effect van mutaties
Inleiding
- Al hetgeen wat we waarnemen postnataal is wat er gebeurd bij de embryonale fase
- Genetische variatie wordt veroorzaakt door wijzingen in de base sequentie:
o Wijzingen die het aantal nucleotiden niet veranderen
▪ Single nucleotide variant
▪ Gebalanceerde structurele variant
o Wijzingen in het kopijaantal van nucleotiden
▪ Eenvoudige deleties / inserties
▪ Wijzingen in kopijaantal van repitieve sequenites en/of volledige chromosomen
DNA varianten, polymorfismen & populatie genomica
- DNA varianten = alternatieve vormen van DNA door een mutatie
- Op basis van grootschalige genoomsequentie → klassen definiëren
Vroeger Jargon in de kliniek nu Momenteel
• Polymorfisme • Polymorfisme • Common DNA variant
− Variant met frequentie van − Variant dat veroorzaakt geen − >0,05
>0,01 in de populatie ziekte • Lage frequentie DNA variant
• Zeldzame • Mutatie − 0,005-0,05
− “ >0,01 in de populatie − “ Veroorzaakt ziekte - Zeldzame DNA variant
• Common SNP − Frequentie <0,005
− “ >0,05
Deze in de toekomst gebruiken
Waarden arbitrair gekozen
- Door de komst van next-generation sequencing (NGS) methodes kunnen we nu populatie-gebaseerde genoomsequencing
o Omstreekts 2008: ‘1000 genomes project’ → identificeren van genetische variatie in 26 versch populaties
o jargon:
▪ Veranderingen van 1-50 nucleotiden = kleinschalig
▪ Grotere + 50 nucleotiden = structurele variatie
Kleinschalige variaties & structurele variaties
Belangrijkste voorbeelden:
- substitutie = nucleotide veranderd in een ander
- deletie = 1 of meer nucleotide verdwijnt
- inversie = evenveel terug als verwijderd, maar gedraaid (vb: CTCGA – TCGAG)
- duplicatie = insertie op 3’ plek van de gekopieerde sequentie
- insertie = 1 of 2 nucleotides toegevoegd & zijn GEEN kopies van een 5’ aangrenzende seq
- conversie = type van insertie / deletie met een gelijkend stukje verderop of eerder in het gen
- deletion/insertion = verandering van 1 of meer nucleotide, waarbij hij vervangd wordt maar zonder gebruik van inversie,
deletie of conversion
4
,kleine deleties en inserties
- single nucleotide varianten (SNV’s) = basesubstiuties en zijn de meest voorkomende puntmutaties
o transities → verandering blijft binnen eenzelfde base (vb: purine)
o transversies → verandering kan van purine – pyrimidine en visa versa
- transities zijn meer frequent:
o doordat het gedomineerd wordt door C-T conversies / mutaties
o gevoelig want de C gaat snel kunnen veranderen / gemuteerd worden en dan lijkend op een T
- kleine inserties & deleties ontstaan vaak door replicatiefouten
o term indel = omschrijft alle typen DNA-veranderingen die een grootteverandering veroorzaken
o bij ‘1000 GP’ werd het gebruikt om kleine inserties / deleties < 50 nucleotiden
Verschillende regio’s en DNA sequenties in het humane genoom hebben verschillende mutatie frequenties
- Vb: mitochrochrondriaal DNA heeft een hogere mutatie frequentie den nucleair
- Open chromatine wordt eerder gerepliceerd dan gebieden van gecondenceerd chromatine
o Open chromatine is meer toegankelijker
o Gecondenseerd “ repliceert veel later & minder toegankelijker → minder tijd en moeilijker om fouten te corrigeren
- Functionele DNA-sequentie zijn onderhevig aan natuurlijke selectie
o Selectiedruk → als de mutatie nadelig is gaan ze verdwijnen
Soorten substituties
- Silent = AZ blijft hetzelfde en zal weinig effect hebben
- Missense = een ander AZ gaat vormen, kan voordelig of nadelig zijn
- Nonsense = stopcodon komt eerder voor, AZ verliest functie
o Chain termination mutation (kijk na indien belangrijk?)
- Splice mutatie = donor of acceptor muteert, gaat exons skippen of een andere zwakkere acceptor / donor gaat gebruiken
o kan leesraam veranderen, prematuur stopcodon, …
Dynamische mutaties
- een typische mutatie frequentie voor een microsateliet is ongeveer 10 4 per locus per generatie
o microsatelliet = 2 – 6 basenparen die herhaald
worden
o hoge freq vaak door een replicatie slippage = bij
DNA-replicatie kan het terug- of vooruitspringen, en
weer verder repliceren
- wanneer een drempelwaarde van herhalingen wordt overgeschreden binnen één gen → microsatellieten instabieler →
resulteer in dynamische mutatie:
o premutatie = regio / lengte waarin de herhaling nog niet groot genoeg is om zelf ziekte te veroorzaken, maar kan
onstabiel worden bij gametogense (= bij kind)
o anticipatie = symptomen vd ziekte heeft de neiging steeds erger te worden in opeenvolgende generaties (= doordat
het telkens verlengd wordt)
5
, - 3 mechanismen waardoor een dynamische mutatie pathogeen kan zijn / worden:
o Loss of function = exon niet meer tot transcriptie
o Gain of function = exon verlengt met CTG
o Gain of function = hetzelfde, maar kan toxisch zijn
Structurele variatie
= zijn grotere variaties, opverdeeld in:
- Gebalanceerd → geen winst of verlies
o Inversies, translocaties (geen winst of verlies, tenzij op breukpunt) en kopienummervarianten (>50 nucleotiden)
o Kan nogsteeds tot een effect lijden, zelfs desastrueus
- Variatie → Winst of Verlies
o Genetische variatie kan leiden tot zowel winst (gain) als verlies (loss) van genetisch materiaal, wat invloed heeft op
de functie van een gen.
o Insertie & Deletie (Indels)
▪ Insertie: Extra DNA-basen worden toegevoegd
▪ Deletie: DNA-basen gaan verloren
• Bv Velocardiofaciaal syndroom: microdeletie in chr 22q11
▪ Beide kunnen invloed hebben op de genfunctie en eiwitten
o CNV’s (copy number variations)
▪ Dit zijn grote DNA-segmenten (≥1 kb) die in variabel aantal kopieën in het genoom voorkomen
▪ Kan leiden tot winst (duplicatie) of verlies (deletie) van genetisch materiaal
▪ CNV’s kunnen functioneel neutraal zijn of invloed hebben op eigenschappen zoals metabolisme of
Ziektegevoeligheid
o Multiallelisch → variabel kopij-aantal
▪ Multiallelisch betekent dat er meer dan twee verschillende versies (allelen) vh het aantal kopieen van een
genetische locus in de populatie bestaan
▪ Verklaard waarom er interindividuele variatie is → dus hoe snel je bv een medicijn opneemt of voedsel
(On)gebalanceerde structurele varianten
- Ongebalanceerde structurele varianten
o Deletie/duplicatie van een deel van een gen, een volledig gen of meerdere genen (contiguous gene syndrome)
- Gebalanceerde structurele varianten
o Inversies, tranlocaties (onderbroken gen, onder controle van nieuwe
genregulatorische elementen, fusiegen,…)
- Andere structurene varianten
o Insertie-mutatie door retrotranspositie (bv L1-element-LINE)
6
, - Transposon-afgeleide herhalingen (mobiele genetische elementen die zich kunnen verplaatsen binnen het genoom en
soms worden gerepliceerd, waardoor ze als herhaalde sequenties achterblijven) zijn een belangrijk onderdeel van het
humane genoom en ontstonden voornamelijk door retrotranspositie
o 40-50% van het menselijk genoom
o Sommige spelen een rol in evolutionaire innovatie en genexpressie
Retrotransposons: de line-1 familie
- Spelen een belangrijke rol bij de retrotranspositie van LINEs,
SINEs, mRNAs en retrogenen → kan leiden tot vorming processes
psuedogenes
o De L1-elemnten zijn retrotransposons, ze odnergaan
transcriptie naar mRNA
o Dit mRNA verhuist naar cytoplasma en vertaald naar 2
eiwitten = endonuclease & reverse transcriptase
o ze zijn een COPY-PASTE mechanisme = het origineel blijdt bestaan en kan verder migerren
o SINE’s en mRNA hebben zelf geen enzymen, liften zij mee op de endonuclease & reverse T, om zichzelf ergens
anders op het genoom te kopiëren → kan leiden tot inactiectieve processed pseudogeen
- Belangrijke kenmerken:
o Integratie gebeurt vaak in AT-rijke regio’s (TTTT/A- motief).
o Slechts 1 op de 100 volledige L1-elementen (ongeveer 6000 van de 60.000) is nog actief.
o De meeste ingebouwde producten zijn korter en vaak inactief (processed pseudogenes)
Whole-genome sequencing
Hierdoor is een directe meting vd mutatiesnelheid in de kiemlijn mogelijk
Ieder van ons vertoont DNA-varianten niet aanwezig in onze biologische ouders = novo-mutaties
- Gemiddelde aantal bij een kind is ong 60 – 70
- Aantal afhankelijk vd leeftijd vd vader, en in mindere mate van maternale leeftijd
- Kinderen met een oudere vader hebben meer mutaties → door spermatogenese is er veel herhalende meiose en mitose
Hoe gelijkaardig zijn humane genomen?
- Van alle menselijke DNA-varianten zijn:
o SNV’s omvatten 87%
o Indels 13%
o Structurele varianten ong 0,05%
- Hoewel SNV’s en korte indels samen goed zijn voor 99,95% van aantal genetische varianten, valt de grote meerderheid
buiten het coderende DNA & andere belangrijke sequenties → neutrale mutaties vertegenwoordigen
7
, - Als we van ieder van ons een DNA seq opstellen & vergelijken met een
referentiegenoom → 4 tot 5 miljoen genetische varianten, meerderheid
zijn neutraal zoals gezegd
o Afh van plaats, afrikanen hebben meer mutaties
- Structurele varianten betreft 0,05%, maar sommige daarvan zijn zeer groot &
sterker gecorreleerd met functionele DNA- sequenties.
o Dragen meer bij aan veranderende genexpressie, fenotype’s en ziek
Effect van mutaties
Alles kan verklaard worden met win of verlies van functie
- Mutaties kunnen op verschillende manieren optreden:
o In de coderende regio
o In RNA verwerking
o In genregulatie of dosering → beïnvloedt hoeveel wordt geproduceerd & waar
- effecten van mutaties:
o loss of function, gain of function, …
o novel property → eiwit vertoont een nieuwe eigenschap
o foute expressie (op het verkeerde moment of cellen)
Haplo-insufficientie
- = oorzaak van een genetische ziekte waarbij de contributie van een normaal allel onvoldoende is om de ziekte te vermijden
door een loss-of-function vh andere allel
- CHARGE-syndroom:
o CHD7 mutaties → DNA chromatine structuur & genexpressie in vroege embryogenese
o Meerdere congenitale afwijkingen:
▪ Coloboma
▪ Hartdefecten
▪ Atresia van de choana
▪ Retardatie van groei en ontwikkeling
▪ Genitale afwijkingen
▪ ‘Ear’ – Oorafwijkingen
o Neurocristopathie → afwijkingen ivm neurale lijst cellen
- dominant negatief effect (= mutatie verhindert ook resterende normale allel in functie)
o Vb: Osteogenesis imperfecta
▪ Collageen type I is belangrijk voor ontwikkeling vd botten → COL1A1 & COL1A2
nodig voor type I vorming
▪ Bij Haplo-insufficientie → 1 allel van COL1A1 verliest zijn functie → te weinig
procollageen productie = milde OI
8
