WEEFSELLEER
HOOFDSTUK 1: HISTOLOGISCHE TECHNIEKEN
ALGEMEEN
DOEL: weefsels en organen observeerbaar maken voor licht- & elektronenmicroscopie
PROBLEMEN: weinig contrast (alles is ongeveer hetzelfde) en weinig licht doorlatend (weefsels zijn
vaak te dik)
BEWERKINGSSTAPPEN om weefsel bruikbaar/observeerbaar te maken:
1- Fixeren
2- Inbedden
3- Snijden
4- Kleuren/contrasteren
STAP 1: FIXEREN
DOEL:
- Bewaren: van weefsels met behoud van oorspronkelijke structuur
= eiwitdenaturatie: veranderen van eiwit structuur waardoor bacteriële & autolytische
afbraakreacties stilliggen
- Permeabiliseren van celmembraan: doorlaatbaar maken
- Harder & poreuzer maken van weefsel
METHODEN:
- Chemische fixatie: via immersie of perfusie van weefsel met een fixatief
o Fixatief: ethanol, azijnzuur, glutaaraldehyde, …
- Koude fixatie: door het invriezen van het weefsel
Artefacten = tijdens fixatie of inbedding van een weefsel kunnen er veranderingen/afwijkingen van de
in vivo situatie
STAP 2: INBEDDEN
DOEL: gefixeerd materiaal omwikkelen en doordrengen met inbedmiddel
KENMERKEN inbedmiddel:
- Dringt in vloeibare vorm in het weefsel
- Na indringer wordt het middel hard
- Materiaal wordt snijdbaar coupes maken
SOORTEN inbedmiddel: paraffine, harsen & plastics
PROBLEEM: inbedmiddelen zijn hydrofoob (waterafstotend) weefsel bevat veel water
OPLOSSING: weefsel moet eerst worden ontwatert/dehydrateren + clearing
- Dehydrateren in stijgende reeksen van alcoholbaden: 30° 50° 70° 90° absolute
ethanol
- Clearing: in tolueen waarbij de alcohol wordt verwisseld met tolueen mengbaar in alcohol
en paraffine
STAP 3: SNIJDEN
DOEL: snijden van weefselblokje (in inbedmiddel) zo dun mogelijke coupes
PARAFFINE: stalen mes - 5 µm (1-20 µm) doorlaatbaar voor licht (lichtmicroscopie)
HARSEN & PLASTICS: glazen/diamantmes - 50 nm – 2 µm: halfdunne coupes (lichtmicroscopie) – 70
nm (60-100 nm): elektronenmicroscopie
STAP 4: KLEUREN (LICHTMICROSCOPIE)
ALGEMEEN
DOEL: visualisatie van cellen, bestanddelen & extracellulair materiaal in weefsels/coupes (anders is
kleurcontrast laag)
- Weefsel bestralen via glazen lenzen met wit licht: spectrum van verschillende golflengtes
(380-720nm)
, Verschillende lichtabsorptie kleurverschillen wij zien het gereflecteerd licht
- PROBLEEM: kleurstoffen zijn waterige oplossingen
OPLOSSING: coupes eerst deparaffineren met tolueen
- SOORTEN kleurstoffen: zuur, basisch & indifferent
HE: HAEMATOXYLINE – EOSINE KLEURING (ROUTING)
Haematoxyline-eosine kleuring: routing kleuring doormiddel van zure en basische kleurstoffen
- ZURE weefselgroepen: H+ ionen afgeven carbonzuren, fosfaten, sulfaten BLAUW
o Eiwitten, DNA/RNA, glycanen
- BASISICHE weefselgroepen: kunnen H+ ionen opnemen amines ROZE
o Eiwitten
- Amfolieten: molecule/deeltje die zowel zuur als basisch kan zijn BIJKLEUREN
pH is zeer bepalend voor resultaat van kleur belang van iso-elektrisch punt (waar molecule
geen lading draagt)
Haematoxyline (KI+OH-) BLAUW
- Kationisch – basische kleurstof
- Basofiel: reageert met zure delen
Eosine (KI-OH-) ROZE
- Anionisch – zure kleurstof
- Eosinofiel: reageert met basische delen
Componenten van kleurstoffen:
- Chromofoor: eigenlijke kleurdrager
- Auxochroom: hydrofiel – maakt kleurstof wateroplosbaar bindt chromofoor aan weefsel
NIET ALTIJD DE BESTE KEUZE:
- Visualisatie van koolhydraten of sachariden: eventueel met basische kleurstoffen
o PROBLEEM: vaak gebonden aan andere moleculen, slecht kleurbaar,
metachromatische kleuren
- Visualisatie van lipiden of vetten
o Vetzuren: hydrofoob & hydrofiel
o PROBLEEM: vetten lossen op in alcohol waardoor je ze verliest tijdens de
weesfelbewerking/fixatie
OPLOSSING: neutrale vetten kleuren met vet oplosbare kleurstoffen (soudan black –
vriescoupes)
OPLOSSING: OsO4 – bindt aan vetzuurketens visualiseerbaar
,Metachromasie: basische kleurstoffen weefsels met veel zure groepen vorming van dimeren
tussen kleurstofmoleculen ROOD (i.p.v. blauw want een basische kleurstof levert blauw)
- Vb.: kraakbeen (kraakbeenmatrix) , mastcellen (granules in cytoplasma)
ANDERE: PAS-KLEURING EN FEULGEN-KLEURING
DOEL: visualiseren van een specifieke chemische groep in cellen en weefsels
PAS-kleuring = period acid-schiff
- Visualiseert polysachariden: vrije polysachariden zoals glycogeen, gebonden aan eiwitten of
lipiden, mucines
- WERKING: glycolgroep aldehydegroepen door oxidatie door perjoodzuur aldehydegroepen
reageren met kleurloos schiff-reagens paars-rode kleur
Feulgen-kleuring = om specifiek DNA in celkernen en chromosomen zichtbaar te maken onder
lichtmicroscoop
, OP AFBEELDING: PAS-kleuring: gobletcells of slijmbekercellen zijn zichtbaar
- Kernen: blauw slijmbekercellen produceren slijm (zie later)
- Cytoplasma: roze enkel zichtbaar met PAS
- Lumen: bijna wit
Epitheelcellen
Enzymhistochemie:
- DOEL: visualiseren van enzymatische activiteit
- Toevoegen specifiek substraat
- Vorming waarneembare neerslag weinig licht wordt doorgelaten
- Aantonen dehydrogenasen, fosfatasen, peroxidasen
o Aantonen peroxidasen:
Toevoegen DAB (deaminobezidase) in gereduceerde vorm vorming neerslag
Autoradiografie:
- DOEL: visualiseren van metabole activiteit
- Toevoegen radioactief gemerkte precursor coupes in contact brengen met fotografische
emulsie
- Vb.: aantonen DNA-synthese in de cel
Immuunhistochemie:
- DOEL: visualiseren van specifieke moleculen via antigen-antilichaam-binding
via antilichaam voorzien van MERKER voor LM, FM of EM
In situ hybridisatie:
- DOEL: visualiseren van specifieke nucleotidenvolgorden in DNA en RNA
Via DNA/RNA-probes voorzien van een merker
MERKERS (van hierboven): vaak fluorescerend:
Fluoriscentiemicroscopie:
- Lichtmicroscopie waarbij gebruikt wordt gemaakt van filters (excitatiefilters/sperfilters)
o Omzetten excitatielicht van korte golflengte emissielicht van langere golflengte door
fluorescentie
- Achtergrondkleuring nodig: fluorescerende delen lichten op tegen een donkere achtergrond
STAP 4: KLEURING (ELEKTRONENMICROSCOPIE)
ALGEMEEN
TEM (transmissie EM) en SEM (scanning EM)
DOEL: visualisatie van cellen, bestanddelen en extracellulair materiaal in weefsel
- Elektronenbundel: versnelde elektronen met 1 golflengte worden via magneetspoelen
gestuurd naar het weefsel
Elektronenverstrooiing: DOORLATEN = zwarting op negatief, NIET DOORLATEN = wel
verstrooid = zwarting op positief
- (Niet-) elektronendense structuren: belangrijk voor aanwezigheid van zware metalen (hoge Z)
PROBLEEM: weefsels tonen weinig densiteitsverschillen
OPLOSSING: verschillen verhogen = contrasteren
Toevoeging zware metalen toename contrast
- Voorbeelden:
o OsO4: al bij fixatief – affiniteit voor vettig zwarting membranen
o Uranylacetaat: reageert met fosfaten & aminogroepen zwarting NZ en eiwitten
o Loodcitraat: reageert met negatieve groepen zwarting NZ
o Contrasteringsvloeistof: uranylacetaat & loodcitraat
OBSERVATIEMETHODEN – LICHTMICROSCOPIE
- Lichtbron = zichtbaar licht
- Beeldvorming: via glazen lenzen
- Met behulp van kleurstoffen
- Vergroting: oculair (10x) en obectielens (4x, 10x, 40x, 100x)
HOOFDSTUK 1: HISTOLOGISCHE TECHNIEKEN
ALGEMEEN
DOEL: weefsels en organen observeerbaar maken voor licht- & elektronenmicroscopie
PROBLEMEN: weinig contrast (alles is ongeveer hetzelfde) en weinig licht doorlatend (weefsels zijn
vaak te dik)
BEWERKINGSSTAPPEN om weefsel bruikbaar/observeerbaar te maken:
1- Fixeren
2- Inbedden
3- Snijden
4- Kleuren/contrasteren
STAP 1: FIXEREN
DOEL:
- Bewaren: van weefsels met behoud van oorspronkelijke structuur
= eiwitdenaturatie: veranderen van eiwit structuur waardoor bacteriële & autolytische
afbraakreacties stilliggen
- Permeabiliseren van celmembraan: doorlaatbaar maken
- Harder & poreuzer maken van weefsel
METHODEN:
- Chemische fixatie: via immersie of perfusie van weefsel met een fixatief
o Fixatief: ethanol, azijnzuur, glutaaraldehyde, …
- Koude fixatie: door het invriezen van het weefsel
Artefacten = tijdens fixatie of inbedding van een weefsel kunnen er veranderingen/afwijkingen van de
in vivo situatie
STAP 2: INBEDDEN
DOEL: gefixeerd materiaal omwikkelen en doordrengen met inbedmiddel
KENMERKEN inbedmiddel:
- Dringt in vloeibare vorm in het weefsel
- Na indringer wordt het middel hard
- Materiaal wordt snijdbaar coupes maken
SOORTEN inbedmiddel: paraffine, harsen & plastics
PROBLEEM: inbedmiddelen zijn hydrofoob (waterafstotend) weefsel bevat veel water
OPLOSSING: weefsel moet eerst worden ontwatert/dehydrateren + clearing
- Dehydrateren in stijgende reeksen van alcoholbaden: 30° 50° 70° 90° absolute
ethanol
- Clearing: in tolueen waarbij de alcohol wordt verwisseld met tolueen mengbaar in alcohol
en paraffine
STAP 3: SNIJDEN
DOEL: snijden van weefselblokje (in inbedmiddel) zo dun mogelijke coupes
PARAFFINE: stalen mes - 5 µm (1-20 µm) doorlaatbaar voor licht (lichtmicroscopie)
HARSEN & PLASTICS: glazen/diamantmes - 50 nm – 2 µm: halfdunne coupes (lichtmicroscopie) – 70
nm (60-100 nm): elektronenmicroscopie
STAP 4: KLEUREN (LICHTMICROSCOPIE)
ALGEMEEN
DOEL: visualisatie van cellen, bestanddelen & extracellulair materiaal in weefsels/coupes (anders is
kleurcontrast laag)
- Weefsel bestralen via glazen lenzen met wit licht: spectrum van verschillende golflengtes
(380-720nm)
, Verschillende lichtabsorptie kleurverschillen wij zien het gereflecteerd licht
- PROBLEEM: kleurstoffen zijn waterige oplossingen
OPLOSSING: coupes eerst deparaffineren met tolueen
- SOORTEN kleurstoffen: zuur, basisch & indifferent
HE: HAEMATOXYLINE – EOSINE KLEURING (ROUTING)
Haematoxyline-eosine kleuring: routing kleuring doormiddel van zure en basische kleurstoffen
- ZURE weefselgroepen: H+ ionen afgeven carbonzuren, fosfaten, sulfaten BLAUW
o Eiwitten, DNA/RNA, glycanen
- BASISICHE weefselgroepen: kunnen H+ ionen opnemen amines ROZE
o Eiwitten
- Amfolieten: molecule/deeltje die zowel zuur als basisch kan zijn BIJKLEUREN
pH is zeer bepalend voor resultaat van kleur belang van iso-elektrisch punt (waar molecule
geen lading draagt)
Haematoxyline (KI+OH-) BLAUW
- Kationisch – basische kleurstof
- Basofiel: reageert met zure delen
Eosine (KI-OH-) ROZE
- Anionisch – zure kleurstof
- Eosinofiel: reageert met basische delen
Componenten van kleurstoffen:
- Chromofoor: eigenlijke kleurdrager
- Auxochroom: hydrofiel – maakt kleurstof wateroplosbaar bindt chromofoor aan weefsel
NIET ALTIJD DE BESTE KEUZE:
- Visualisatie van koolhydraten of sachariden: eventueel met basische kleurstoffen
o PROBLEEM: vaak gebonden aan andere moleculen, slecht kleurbaar,
metachromatische kleuren
- Visualisatie van lipiden of vetten
o Vetzuren: hydrofoob & hydrofiel
o PROBLEEM: vetten lossen op in alcohol waardoor je ze verliest tijdens de
weesfelbewerking/fixatie
OPLOSSING: neutrale vetten kleuren met vet oplosbare kleurstoffen (soudan black –
vriescoupes)
OPLOSSING: OsO4 – bindt aan vetzuurketens visualiseerbaar
,Metachromasie: basische kleurstoffen weefsels met veel zure groepen vorming van dimeren
tussen kleurstofmoleculen ROOD (i.p.v. blauw want een basische kleurstof levert blauw)
- Vb.: kraakbeen (kraakbeenmatrix) , mastcellen (granules in cytoplasma)
ANDERE: PAS-KLEURING EN FEULGEN-KLEURING
DOEL: visualiseren van een specifieke chemische groep in cellen en weefsels
PAS-kleuring = period acid-schiff
- Visualiseert polysachariden: vrije polysachariden zoals glycogeen, gebonden aan eiwitten of
lipiden, mucines
- WERKING: glycolgroep aldehydegroepen door oxidatie door perjoodzuur aldehydegroepen
reageren met kleurloos schiff-reagens paars-rode kleur
Feulgen-kleuring = om specifiek DNA in celkernen en chromosomen zichtbaar te maken onder
lichtmicroscoop
, OP AFBEELDING: PAS-kleuring: gobletcells of slijmbekercellen zijn zichtbaar
- Kernen: blauw slijmbekercellen produceren slijm (zie later)
- Cytoplasma: roze enkel zichtbaar met PAS
- Lumen: bijna wit
Epitheelcellen
Enzymhistochemie:
- DOEL: visualiseren van enzymatische activiteit
- Toevoegen specifiek substraat
- Vorming waarneembare neerslag weinig licht wordt doorgelaten
- Aantonen dehydrogenasen, fosfatasen, peroxidasen
o Aantonen peroxidasen:
Toevoegen DAB (deaminobezidase) in gereduceerde vorm vorming neerslag
Autoradiografie:
- DOEL: visualiseren van metabole activiteit
- Toevoegen radioactief gemerkte precursor coupes in contact brengen met fotografische
emulsie
- Vb.: aantonen DNA-synthese in de cel
Immuunhistochemie:
- DOEL: visualiseren van specifieke moleculen via antigen-antilichaam-binding
via antilichaam voorzien van MERKER voor LM, FM of EM
In situ hybridisatie:
- DOEL: visualiseren van specifieke nucleotidenvolgorden in DNA en RNA
Via DNA/RNA-probes voorzien van een merker
MERKERS (van hierboven): vaak fluorescerend:
Fluoriscentiemicroscopie:
- Lichtmicroscopie waarbij gebruikt wordt gemaakt van filters (excitatiefilters/sperfilters)
o Omzetten excitatielicht van korte golflengte emissielicht van langere golflengte door
fluorescentie
- Achtergrondkleuring nodig: fluorescerende delen lichten op tegen een donkere achtergrond
STAP 4: KLEURING (ELEKTRONENMICROSCOPIE)
ALGEMEEN
TEM (transmissie EM) en SEM (scanning EM)
DOEL: visualisatie van cellen, bestanddelen en extracellulair materiaal in weefsel
- Elektronenbundel: versnelde elektronen met 1 golflengte worden via magneetspoelen
gestuurd naar het weefsel
Elektronenverstrooiing: DOORLATEN = zwarting op negatief, NIET DOORLATEN = wel
verstrooid = zwarting op positief
- (Niet-) elektronendense structuren: belangrijk voor aanwezigheid van zware metalen (hoge Z)
PROBLEEM: weefsels tonen weinig densiteitsverschillen
OPLOSSING: verschillen verhogen = contrasteren
Toevoeging zware metalen toename contrast
- Voorbeelden:
o OsO4: al bij fixatief – affiniteit voor vettig zwarting membranen
o Uranylacetaat: reageert met fosfaten & aminogroepen zwarting NZ en eiwitten
o Loodcitraat: reageert met negatieve groepen zwarting NZ
o Contrasteringsvloeistof: uranylacetaat & loodcitraat
OBSERVATIEMETHODEN – LICHTMICROSCOPIE
- Lichtbron = zichtbaar licht
- Beeldvorming: via glazen lenzen
- Met behulp van kleurstoffen
- Vergroting: oculair (10x) en obectielens (4x, 10x, 40x, 100x)
