Samenvatting les 3- inhibitie (vervolg)
pH afhankelijkheid
Algemeen: pH is afhankelijk van:
-Eiwitstructuur
- substraatbinding (en cofactoren)
-Substraationisatie
-Katalyse zelf
(elk enzym is pH afhankelijk)
Elk enzym heeft:
-pH-optimum
-pH-interval voor enzymstabiliteit
Belangrijk voor optimale toepassing en
opbrengst
-Indien enzym gebonden is aan drager pH
effect op binding controleren
Bepaling pH-optimum
-Bepaald bij substraatconcentratie in substraatverzadegingsgebied-> enzymactiviteit
dan maximaal, waardoor invloed pH op enzymactiviteit zonder beperkingen door
substraat kan worden gemeten
-door activiteit te meten bij verschillende pH-waarden (gedurende tijd waarbij enzyme
niet denatureerd)->buffers van verschillende pH waarden->hiervan reactiemengsels
gemaakt
-waarom optimale pH voor katalyse? ->
pH beïnvloedt ladingen van AZ in actieve centrum.
enzymactiviteit maximaal bij optimale pH
Afwijkende pH-waarden verstoren structuur/functie enzym
-keuze buffer belangrijk bij Fosfaat, Tris- en diethanolaminebuffers, kunnen
inhiberend/activerend werken op bepaalde enzyme
1
, Verteringsenzymen hebben een basischere
pH
Bepaling enzymstabiliteit
-enzym geincubeerd bij bepaalde pH
Op verschillende tijdstippen:
• Staal incubatiemengsel + in optimale reactie-omstandigheden gebracht
• Reactiesnelheid bepaald:
• Reactiesnelheid veranderd niet i.f.v. incubatietijd: enzyme stabiel bij die pH
• Daling reactiesnelheid : denaturatie
Bredere curve je ziet dat er stabiliteit is bij
het vlakke stuk
Vastellen denaturatie
-Hoge concentratie: troebelheid/neerslag
-Lage concentratie: kan je niet vaststellen,
geen lineair verband tussen in
reactiesnelheid en incubatietijd <->
substraatuitputting!
-enzyme- of substraat tekort
Afwijking lineariteit door substraatuitputting
of denaturatie:
Substraatuitputting: als je substraat
toevoegt en dan terug een stijging hebt van
de extinctie.
2 Denaturatie: als je substraat toevoegt , maar
dit geen effect heeft op de extinctie
Oef p 90
, T-afhankelijkheid
Temperatuur afhankelijkheid
Chemisch effect: reactiesnelheid neemt toe ifv
temperatuur (alt T stijgt)
Denaturerend effect:
-Hoge T irreversibele denaturatie (reactie stopt)
-Meestal 50-60°C
- optimale T (max reactiesnelheid), net onder
inactivatietemperatuur
- lage T reactiesnelheid neemt af, maar
structuur stabieler enzyme/biologische
stalen/voeding koud bewaard
-bij een aantal enzyme inactievatietemperatuur
hoger, gebruik van gemaakt omdat: ongewenste
eiwitten selectief te denatureren, terwijl gewenste
enzym actief blijft. Dit maakt zuivering efficiënter
en goedkoper, vooral bij thermostabiele enzymen
-T beinvloed ook Km en Vmax
-Enzymactiviteit en extinctiewaarde zijn T-afh.
werken bij constante T
-pH waarde van bufferoplossingen is temperatuur
afhankelijk
Meetmethoden
3
pH afhankelijkheid
Algemeen: pH is afhankelijk van:
-Eiwitstructuur
- substraatbinding (en cofactoren)
-Substraationisatie
-Katalyse zelf
(elk enzym is pH afhankelijk)
Elk enzym heeft:
-pH-optimum
-pH-interval voor enzymstabiliteit
Belangrijk voor optimale toepassing en
opbrengst
-Indien enzym gebonden is aan drager pH
effect op binding controleren
Bepaling pH-optimum
-Bepaald bij substraatconcentratie in substraatverzadegingsgebied-> enzymactiviteit
dan maximaal, waardoor invloed pH op enzymactiviteit zonder beperkingen door
substraat kan worden gemeten
-door activiteit te meten bij verschillende pH-waarden (gedurende tijd waarbij enzyme
niet denatureerd)->buffers van verschillende pH waarden->hiervan reactiemengsels
gemaakt
-waarom optimale pH voor katalyse? ->
pH beïnvloedt ladingen van AZ in actieve centrum.
enzymactiviteit maximaal bij optimale pH
Afwijkende pH-waarden verstoren structuur/functie enzym
-keuze buffer belangrijk bij Fosfaat, Tris- en diethanolaminebuffers, kunnen
inhiberend/activerend werken op bepaalde enzyme
1
, Verteringsenzymen hebben een basischere
pH
Bepaling enzymstabiliteit
-enzym geincubeerd bij bepaalde pH
Op verschillende tijdstippen:
• Staal incubatiemengsel + in optimale reactie-omstandigheden gebracht
• Reactiesnelheid bepaald:
• Reactiesnelheid veranderd niet i.f.v. incubatietijd: enzyme stabiel bij die pH
• Daling reactiesnelheid : denaturatie
Bredere curve je ziet dat er stabiliteit is bij
het vlakke stuk
Vastellen denaturatie
-Hoge concentratie: troebelheid/neerslag
-Lage concentratie: kan je niet vaststellen,
geen lineair verband tussen in
reactiesnelheid en incubatietijd <->
substraatuitputting!
-enzyme- of substraat tekort
Afwijking lineariteit door substraatuitputting
of denaturatie:
Substraatuitputting: als je substraat
toevoegt en dan terug een stijging hebt van
de extinctie.
2 Denaturatie: als je substraat toevoegt , maar
dit geen effect heeft op de extinctie
Oef p 90
, T-afhankelijkheid
Temperatuur afhankelijkheid
Chemisch effect: reactiesnelheid neemt toe ifv
temperatuur (alt T stijgt)
Denaturerend effect:
-Hoge T irreversibele denaturatie (reactie stopt)
-Meestal 50-60°C
- optimale T (max reactiesnelheid), net onder
inactivatietemperatuur
- lage T reactiesnelheid neemt af, maar
structuur stabieler enzyme/biologische
stalen/voeding koud bewaard
-bij een aantal enzyme inactievatietemperatuur
hoger, gebruik van gemaakt omdat: ongewenste
eiwitten selectief te denatureren, terwijl gewenste
enzym actief blijft. Dit maakt zuivering efficiënter
en goedkoper, vooral bij thermostabiele enzymen
-T beinvloed ook Km en Vmax
-Enzymactiviteit en extinctiewaarde zijn T-afh.
werken bij constante T
-pH waarde van bufferoplossingen is temperatuur
afhankelijk
Meetmethoden
3
