GeneticaGenomica
H3: DNA-replicatie
1. Principe van DNA replicatie
= Watson-Crick model of DNA replication
Kort gezegd:
• Waterstofbruggen tussen DNA-basen breken om strengscheiding mogelijk te maken
• Elke DNA-streng is een matrijs (= template) voor de synthese van een nieuwe streng
• De matrijs (ouderlijke) streng bepaalt de basenvolgorde in de nieuwe (dochter) streng
= complementaire basenparingregels
Enkele bergrippen over replicatie:
• Semi-conservatief = elke orginele DNA streng is een template voor een nieuwe streng die
complementair is aan die orginele streng
• → nieuw gemaakt DNA heeft dus één nieuwe en één orginele streng
• DNA synthese is bi-directioneel = synthese gaat in twee verschillende richtingen op de
orginele dubbelsteng
- Startplaats = origin of replication (OR)
2. DNA-polymerase
= enzym van belang van aanmaak nieuw DNA
Functie:
• Voegt nucleotiden toe aan de groeiende DNA-keten
• Hoe? = door de splitsing van twee fosfaatgroepen en de aanhechting van het nucleosidemonofosfaat aan
de 3’-OH van het aangrenzende deoxyribosesuiker
- Door twee P af te splitsen komt E vrij en deze wordt gebruikt om een nieuwe binding te maken
- Binding = fosfodi-esterbinding
Streng verlengt = van 5’- tot- 3’
Streng afgelezen = van 3’ tot 5’ (bij eiwitsynthese)
Mg2+ : essentieel voor werking DNA-polymerasen
• Maakt het 3’-OH reactief → door deprotoneren (C meer + vr nucleofiel)
• Stabiliseerd negatieve fosfaatgroepen van het dNTP → minder – en dus minder afstoting
• Stabiliseren overgangstoestand → stabiliseren P-P dat wordt vrijgemaakt
1
, Nucleasen: enzymen die fosfodi-ester bindingen knippen
• Exonucelease = knipt / verwijdert nucleotiden vanaf de uiteinden van een nucleïnezuurketen
- bij DNA-Polymerase → gebruikt voor proeflezen (proofreading).
• Endonuclease = knipt de nucleïnezuurketen ergens in het midden van de keten (een interne knip)
- creëert kortere fragmenten
- Restrictie-endonucleasen (vaak 'restrictie-enzymen' genoemd) = knippen DNA op zeer specifieke
sequenties
- zijn ook essentieel in verschillende DNA-herstel processen om beschadigde segmenten te
verwijderen, evenals bij de verwerking en rijping van RNA
Proofreading functie = Als ze iets verkeerd bouwt kan ze niet verder en weet ze dat er iets fout is
• Heeft dus ook een exonuclease functie (dus is geen appart enzym !!)
• Exonuclease functie = verwijderd verkeerd gepaarde basen
DNA polymerasen bij eukaryoten:
• In één cel : meer dan 15 verschillene polymerases
• In primair genoom : 3 (hoofd)polymerases
- Polymerase α (alfa) = RNA/DNA-primers, initiatie van DNA-synthese
- Polymerase δ (delta) = synthese van de lagging strand, reparatie, recombinatie, proofreading
- Polymerase ε (epsilon) = synthese van de leading strand, reparatie, recombinatie, proofreading
DNA-polymerasen bij E.coli:
Pol I Pol II Pol III (holoenyzm = complex van meerdere
subeenheden)
Subeenheden 1 >4 > 10
3’-5’ exo (proeflees) ja ja ja
5’-3’ exo ja nee nee
Processiviteit (= hoe lang ze blijven laag hoog zeer hoog
werken om DNA te maken
+ Pol IV en Pol V = herstelfunctie
DNA-polymerase III: structuur
= bestaat uit 3 grote stukken → 3 groepen van subeenheden
1) Kern-enzym = subeenheid α (grootste) + subeenheden ε en θ
• Katalytische functie
• In E. coli = elk holo-enzym twee/ drie kern-enzymcomplexen
• α-subeenheid = DNA-synthese langs de templatestrengen
• ε-subeenheid = heeft 3′→5′ exonuclease-activiteit (proofreading)
2) Sliding clamp loader = groep van vijf subeenheden (γ, δ, δ′, χ en ψ)
• koppelt aan het kern-enzym + ondersteunt de functie van de sliding DNA clamp ( 3) )
• De enzymatische werking is afhankelijk van energie van ATP
2
H3: DNA-replicatie
1. Principe van DNA replicatie
= Watson-Crick model of DNA replication
Kort gezegd:
• Waterstofbruggen tussen DNA-basen breken om strengscheiding mogelijk te maken
• Elke DNA-streng is een matrijs (= template) voor de synthese van een nieuwe streng
• De matrijs (ouderlijke) streng bepaalt de basenvolgorde in de nieuwe (dochter) streng
= complementaire basenparingregels
Enkele bergrippen over replicatie:
• Semi-conservatief = elke orginele DNA streng is een template voor een nieuwe streng die
complementair is aan die orginele streng
• → nieuw gemaakt DNA heeft dus één nieuwe en één orginele streng
• DNA synthese is bi-directioneel = synthese gaat in twee verschillende richtingen op de
orginele dubbelsteng
- Startplaats = origin of replication (OR)
2. DNA-polymerase
= enzym van belang van aanmaak nieuw DNA
Functie:
• Voegt nucleotiden toe aan de groeiende DNA-keten
• Hoe? = door de splitsing van twee fosfaatgroepen en de aanhechting van het nucleosidemonofosfaat aan
de 3’-OH van het aangrenzende deoxyribosesuiker
- Door twee P af te splitsen komt E vrij en deze wordt gebruikt om een nieuwe binding te maken
- Binding = fosfodi-esterbinding
Streng verlengt = van 5’- tot- 3’
Streng afgelezen = van 3’ tot 5’ (bij eiwitsynthese)
Mg2+ : essentieel voor werking DNA-polymerasen
• Maakt het 3’-OH reactief → door deprotoneren (C meer + vr nucleofiel)
• Stabiliseerd negatieve fosfaatgroepen van het dNTP → minder – en dus minder afstoting
• Stabiliseren overgangstoestand → stabiliseren P-P dat wordt vrijgemaakt
1
, Nucleasen: enzymen die fosfodi-ester bindingen knippen
• Exonucelease = knipt / verwijdert nucleotiden vanaf de uiteinden van een nucleïnezuurketen
- bij DNA-Polymerase → gebruikt voor proeflezen (proofreading).
• Endonuclease = knipt de nucleïnezuurketen ergens in het midden van de keten (een interne knip)
- creëert kortere fragmenten
- Restrictie-endonucleasen (vaak 'restrictie-enzymen' genoemd) = knippen DNA op zeer specifieke
sequenties
- zijn ook essentieel in verschillende DNA-herstel processen om beschadigde segmenten te
verwijderen, evenals bij de verwerking en rijping van RNA
Proofreading functie = Als ze iets verkeerd bouwt kan ze niet verder en weet ze dat er iets fout is
• Heeft dus ook een exonuclease functie (dus is geen appart enzym !!)
• Exonuclease functie = verwijderd verkeerd gepaarde basen
DNA polymerasen bij eukaryoten:
• In één cel : meer dan 15 verschillene polymerases
• In primair genoom : 3 (hoofd)polymerases
- Polymerase α (alfa) = RNA/DNA-primers, initiatie van DNA-synthese
- Polymerase δ (delta) = synthese van de lagging strand, reparatie, recombinatie, proofreading
- Polymerase ε (epsilon) = synthese van de leading strand, reparatie, recombinatie, proofreading
DNA-polymerasen bij E.coli:
Pol I Pol II Pol III (holoenyzm = complex van meerdere
subeenheden)
Subeenheden 1 >4 > 10
3’-5’ exo (proeflees) ja ja ja
5’-3’ exo ja nee nee
Processiviteit (= hoe lang ze blijven laag hoog zeer hoog
werken om DNA te maken
+ Pol IV en Pol V = herstelfunctie
DNA-polymerase III: structuur
= bestaat uit 3 grote stukken → 3 groepen van subeenheden
1) Kern-enzym = subeenheid α (grootste) + subeenheden ε en θ
• Katalytische functie
• In E. coli = elk holo-enzym twee/ drie kern-enzymcomplexen
• α-subeenheid = DNA-synthese langs de templatestrengen
• ε-subeenheid = heeft 3′→5′ exonuclease-activiteit (proofreading)
2) Sliding clamp loader = groep van vijf subeenheden (γ, δ, δ′, χ en ψ)
• koppelt aan het kern-enzym + ondersteunt de functie van de sliding DNA clamp ( 3) )
• De enzymatische werking is afhankelijk van energie van ATP
2
