GeneticaGenomica
H2: structuur van DNA & samenstelling genoom
1. Bouwstenen en structuur van DNA en RNA
= nucleïnezuren
= bestaan uit nucleotiden
Nucleotiden:
• pyrimidine- of purinebase
• (deoxy)ribose (suikergroep) → bij deoxy is er een O minder (OH vervangen door H)
• Fosforzuur
Natuurlijke nucleïnezuren = DNA (de(s)oxyribonucleïnezuur) en RNA (ribonucleïnezuur)
➔ keten van nucleotiden (polynucleotiden)
Pyrimidine -en purinebasen:
= basisstructuur van de stikstofbasen in nucleotiden
Purines = adenine (A) en guanine (G)
• Twee ringen (één 6 en een 5)
• A zit aan G met H-bruggen (zelfde bij C en T/U)
Pyrimidines = uracil (U), tymine (T) en cytosine (C)
• Één ring
• T = bij DNA en U = bij RNA
- Enige verschil in structuur is een methylgroep bij T → zorgt dat heel molecule fotostabieler is
- = minder gevoelig voor licht → DNA is mindergevoelig aan fotodegradatie dan RNA
- Belangrijk zodat we geen kanker krijgen
1.1. Bindingen
Nucleoside = pyrimidine/purinebase + D-(deoxy)ribofuranose
Nucleotide = pyrimidine/purinebase + D-(deoxy)ribofuranose + fosfaatgroep
Bindingen: nucleoside
• Base bindt aan hemi-acetylgroep (C1) van D-(deoxy)ribofuranose
• vorming N-glycosidische binding (in β-configuratie)
→ binding tussen C1 van suikergroep met N1 van pyrimidinebase OF N9
van purinebaseBindingen: nucleotide
• Meestal binding tussen C5 van suikergroep en ester van P-
Base en suiker = 2 vlakke ringen → stabielste conformatie (minste
sterische hinder)
beide ringen loodrecht op elkaar
1
, Bindingen: nucleotide
• Meestal binding tussen C5 van suikergroep en ester van P-
Base en suiker = 2 vlakke ringen → stabielste conformatie (minste sterische hinder)
beide ringen loodrecht op elkaar
Naamgeving en afkortingen:
Base Symbool Nucleoside 5’- Afkorting Nucleoside 5’- Afkorting
(ribo) Ribonucleotide (deoxy) Deoxyribonucleotide
Adenine A adenosine adenosine-5’- AMP deoxyadenosine deoxyadenosine-5’- dAMP
monofosfaat monofosfaat
Guanine G guanosine guanosine-5’- GMP deoxyguanosine deoxyguanosine-5’- dGMP
monofosfaat monofosfaat
Cytosine C cytidine cytidine-5’- CMP deoxycytidine deoxycytidine-5’- dCMP
monofosfaat monofosfaat
Uracil U uridine uridine-5’- UMP / / /
monofosfaat
Thymine T / / / thymidine thymidine-5’- dTMP
monofosfaat
1.2. Vorming dubbele helix DNA
Opbouw DNA:
• = twee deoxyribonucleïneketens die antiparallel tegenover elkaar staan
• Basen van de twee strengen = verbonden via H-bruggen
- Dus A van streng 1 met T van streng 2 , …
- deze combinaties geven de meest stabiele H-bruggen
→ altijd even veel A-T/G-C
→ steeds complementaire keten vinden
• Spiraalstructuur = dubbele helix (basen naar binnen gericht)
H-bruggen: niet heel sterke interacties
• Denaturatie = alle secundaire interacties tussen de twee strengen verbroken
• Gevolg = onregelmatige statistische kluwen formatie in oplossing (E=random coil)
• → helix-kluwen transitie (E=helix-to-coil transition)
1.3. Denaturatie van DNA
= kan door temperatuur en licht
Hyperchromiciteit: fenomeen waarbij de absorptie van UV-licht door een oplossing van DNA drastisch
toeneemt wanneer het dubbelstrengs-DNA verandert in enkelstrengs-DNA
• toename in de hoeveelheid UV-licht die wordt geabsorbeerd door nucleïnezuren bij golflengte 260 nm
• Oorzaak = basen van DNA absorberen UV-licht
- In dubbele helix = basen zijn geordend gestapeld in het midden van de → vermogen om UV-licht te
absorberen onderdrukt (= hypochroom effect)
• Na denaturatie = twee strengen scheiden en basen komen vrij te liggen
→ onderdrukking valt weg → basen kunnen nu veel meer UV-licht absorberen = toename van absorptie
(ongeveer 40%)
• gebruikt om het proces van DNA-denaturatie (of "smelten") te volgen en te meten → smeltcurve
2
, Smeltcurve:
= sigmoïde curve met lichtabsortpie in functie van temperatuur
• wijst op coöperatief karakter van de interacties tussen de basenparen in DNA
• Tm = smelttemp. → temp. waarbij precies 50% van het dubbelstrengs-DNA gedenatureerd (gesmolten) is
- unieke, karakteristieke eigenschap van een DNA-molecuul → geeft informatie over de stabiliteit
• Wat zegt de Tm?
= GC-gehalte
- Tm is direct afhankelijk van het percentage Guanine (G) en
Cytosine (C)
- DNA met een hoger GC-gehalte = stabieler (meer H-bruggen)
- → vereist een hogere temperatuur om te denatureren (Tm)
Reassociatie/renaturatie van thermisch gedenatureerd DNA:
= mogelijk onder specifieke experimentele omstandigheden
1) Zout conc. moet hoog genoeg zijn op repulsie tussen de – geladen fosfaatgroepen can de reassociërende
strengen te verhindenen → men gebruik 0,2 M NaCl
2) Temp. moet hoog genoeg zijn om de vorming van intra-keten H-briggen in de enkelstrengen te
verhinderen. Best om het DNA langzaal af te koelen tot een temp. van 25°C onder Tm
Proces kan fotospectrisch worden gevolgd
Annealing
1.4. Polariteit van DNA
DNA streng: aaneenschakeling van nucleotiden
• P groep van nucleotide 2 bindt aan 3’ C van nucleotide 1
→ fosfodiesterbinding
• Zie figuur
Polariteit: richting
• Streng heeft een richting =Als er iets wordt toegevoegd, is dit
aan 3’
- Bouw = richting is 5’→3’
• aan de 5' kant een fosfaat
• aan de 3' kant een OH-groep
is de streng asymmetrisch
dit heet polariteit
3
H2: structuur van DNA & samenstelling genoom
1. Bouwstenen en structuur van DNA en RNA
= nucleïnezuren
= bestaan uit nucleotiden
Nucleotiden:
• pyrimidine- of purinebase
• (deoxy)ribose (suikergroep) → bij deoxy is er een O minder (OH vervangen door H)
• Fosforzuur
Natuurlijke nucleïnezuren = DNA (de(s)oxyribonucleïnezuur) en RNA (ribonucleïnezuur)
➔ keten van nucleotiden (polynucleotiden)
Pyrimidine -en purinebasen:
= basisstructuur van de stikstofbasen in nucleotiden
Purines = adenine (A) en guanine (G)
• Twee ringen (één 6 en een 5)
• A zit aan G met H-bruggen (zelfde bij C en T/U)
Pyrimidines = uracil (U), tymine (T) en cytosine (C)
• Één ring
• T = bij DNA en U = bij RNA
- Enige verschil in structuur is een methylgroep bij T → zorgt dat heel molecule fotostabieler is
- = minder gevoelig voor licht → DNA is mindergevoelig aan fotodegradatie dan RNA
- Belangrijk zodat we geen kanker krijgen
1.1. Bindingen
Nucleoside = pyrimidine/purinebase + D-(deoxy)ribofuranose
Nucleotide = pyrimidine/purinebase + D-(deoxy)ribofuranose + fosfaatgroep
Bindingen: nucleoside
• Base bindt aan hemi-acetylgroep (C1) van D-(deoxy)ribofuranose
• vorming N-glycosidische binding (in β-configuratie)
→ binding tussen C1 van suikergroep met N1 van pyrimidinebase OF N9
van purinebaseBindingen: nucleotide
• Meestal binding tussen C5 van suikergroep en ester van P-
Base en suiker = 2 vlakke ringen → stabielste conformatie (minste
sterische hinder)
beide ringen loodrecht op elkaar
1
, Bindingen: nucleotide
• Meestal binding tussen C5 van suikergroep en ester van P-
Base en suiker = 2 vlakke ringen → stabielste conformatie (minste sterische hinder)
beide ringen loodrecht op elkaar
Naamgeving en afkortingen:
Base Symbool Nucleoside 5’- Afkorting Nucleoside 5’- Afkorting
(ribo) Ribonucleotide (deoxy) Deoxyribonucleotide
Adenine A adenosine adenosine-5’- AMP deoxyadenosine deoxyadenosine-5’- dAMP
monofosfaat monofosfaat
Guanine G guanosine guanosine-5’- GMP deoxyguanosine deoxyguanosine-5’- dGMP
monofosfaat monofosfaat
Cytosine C cytidine cytidine-5’- CMP deoxycytidine deoxycytidine-5’- dCMP
monofosfaat monofosfaat
Uracil U uridine uridine-5’- UMP / / /
monofosfaat
Thymine T / / / thymidine thymidine-5’- dTMP
monofosfaat
1.2. Vorming dubbele helix DNA
Opbouw DNA:
• = twee deoxyribonucleïneketens die antiparallel tegenover elkaar staan
• Basen van de twee strengen = verbonden via H-bruggen
- Dus A van streng 1 met T van streng 2 , …
- deze combinaties geven de meest stabiele H-bruggen
→ altijd even veel A-T/G-C
→ steeds complementaire keten vinden
• Spiraalstructuur = dubbele helix (basen naar binnen gericht)
H-bruggen: niet heel sterke interacties
• Denaturatie = alle secundaire interacties tussen de twee strengen verbroken
• Gevolg = onregelmatige statistische kluwen formatie in oplossing (E=random coil)
• → helix-kluwen transitie (E=helix-to-coil transition)
1.3. Denaturatie van DNA
= kan door temperatuur en licht
Hyperchromiciteit: fenomeen waarbij de absorptie van UV-licht door een oplossing van DNA drastisch
toeneemt wanneer het dubbelstrengs-DNA verandert in enkelstrengs-DNA
• toename in de hoeveelheid UV-licht die wordt geabsorbeerd door nucleïnezuren bij golflengte 260 nm
• Oorzaak = basen van DNA absorberen UV-licht
- In dubbele helix = basen zijn geordend gestapeld in het midden van de → vermogen om UV-licht te
absorberen onderdrukt (= hypochroom effect)
• Na denaturatie = twee strengen scheiden en basen komen vrij te liggen
→ onderdrukking valt weg → basen kunnen nu veel meer UV-licht absorberen = toename van absorptie
(ongeveer 40%)
• gebruikt om het proces van DNA-denaturatie (of "smelten") te volgen en te meten → smeltcurve
2
, Smeltcurve:
= sigmoïde curve met lichtabsortpie in functie van temperatuur
• wijst op coöperatief karakter van de interacties tussen de basenparen in DNA
• Tm = smelttemp. → temp. waarbij precies 50% van het dubbelstrengs-DNA gedenatureerd (gesmolten) is
- unieke, karakteristieke eigenschap van een DNA-molecuul → geeft informatie over de stabiliteit
• Wat zegt de Tm?
= GC-gehalte
- Tm is direct afhankelijk van het percentage Guanine (G) en
Cytosine (C)
- DNA met een hoger GC-gehalte = stabieler (meer H-bruggen)
- → vereist een hogere temperatuur om te denatureren (Tm)
Reassociatie/renaturatie van thermisch gedenatureerd DNA:
= mogelijk onder specifieke experimentele omstandigheden
1) Zout conc. moet hoog genoeg zijn op repulsie tussen de – geladen fosfaatgroepen can de reassociërende
strengen te verhindenen → men gebruik 0,2 M NaCl
2) Temp. moet hoog genoeg zijn om de vorming van intra-keten H-briggen in de enkelstrengen te
verhinderen. Best om het DNA langzaal af te koelen tot een temp. van 25°C onder Tm
Proces kan fotospectrisch worden gevolgd
Annealing
1.4. Polariteit van DNA
DNA streng: aaneenschakeling van nucleotiden
• P groep van nucleotide 2 bindt aan 3’ C van nucleotide 1
→ fosfodiesterbinding
• Zie figuur
Polariteit: richting
• Streng heeft een richting =Als er iets wordt toegevoegd, is dit
aan 3’
- Bouw = richting is 5’→3’
• aan de 5' kant een fosfaat
• aan de 3' kant een OH-groep
is de streng asymmetrisch
dit heet polariteit
3
