H10: DNA-herstel systemen
DNA-herstelmechanismen
Cellen beschikken over verschillende DNA-herstelmechanismen en ontsnappingsroutes
(zoals nonsense-mediated decay) om mutaties te herstellen en om beschadigde RNA- en
eiwitmoleculen te verwijderen.
De meeste herstelmechanismen werken volgens hetzelfde principe:
1. Het beschadigde DNA-segment wordt uit de dubbele helix verwijderd
2. DNA-polymerase vult de opening opnieuw op door gebruik te maken van de
complementaire streng als matrijs
3. DNA-ligase sluit het herstelde stuk aan door de fosfodiësterbrug te vormen
Bij bepaalde soorten schade, zoals interstreng crosslinks of dubbelstrengs breuken,
moeten beide DNA-strengen worden hersteld. Het verlies van deze mechanismen
verhoogt de kans op kanker.
In hogere eukaryoten bestaan meerdere DNA-polymerasen die essentieel zijn voor de
replicatie van het kern-DNA, naast gespecialiseerde polymerasen die betrokken zijn bij
herstel van beschadigd DNA.
Rol van de belangrijkste polymerasen
o DNA-polymerase α vormt samen met een primase een complex dat
RNA-primers aanmaakt voor de synthese van Okazaki-fragmenten aan de
lagging strand. Het verlengt deze primers kort met DNA-nucleotiden.
o Daarna nemen DNA-polymerase δ en DNA-polymerase ε de synthese over:
Pol ε: continue synthese van de leading strand
Pol δ: discontinue synthese van de lagging strand
o Beide polymerasen hebben 3'→5' exonuclease-activiteit voor proofreading
Okazaki-fragmenten zijn korter dan in prokaryoten
Belangrijke eiwitten in de replicatiemachine
o RFA (Replication Factor A): functioneert als SSB-eiwit, beschermt
enkelstrengs DNA
o PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen): de glijdende klem die het
polymerase aan het DNA houdt
o RFC (Replication Factor C): de klem-lader die PCNA op de primer-template
plaatst
Helicase en topoisomerase
o MCM2-7-complex, samen met CMG-complex (Cdc45, Mcm10, GINS), vormt
de helicase die de DNA-duplex ontwindt
o Topoisomerase I en II verwijderen torsiespanning (supercoils) aan de
replicatievork
Verwijderen van RNA-primers
o FEN1 maakt een knip tussen RNA-primer en nieuw DNA
o RNase H verwijdert de resterende RNA-primer
o DNA-polymerase δ vult het ontstane hiaat op
o DNA-ligase verbindt de Okazaki-fragmenten tot een continue streng
De proofreading functie van DNA-polymerase
,Tijdens de DNA-replicatie kunnen er foutieve basen ingebouwd worden. Het 3'→5'
exonuclease-proofreading systeem van het DNA-polymerase verwijderd deze foutieve
basen
Fotoreactieve herstel
Fotoreactivatie is een lichtafhankelijk DNA-herstelsysteem dat pyrimidine-dimeren (T-T,
C-C, C-T) en vergelijkbare helixvervormingen kan herstellen. Het komt voor in bacteriën
en sommige eukaryoten zoals wieren, maar niet in de mens.
Werkingsprincipe
Een DNA-fotolyase (gecodeerd door het phr-gen) herkent en bindt in het donker
aan een pyrimidine-dimeer
Bij blootstelling aan blauw licht (300–500 nm) wordt het enzym geactiveerd en
wordt de cyclobutaanring tussen de twee pyrimidinebasen verbroken, waardoor de
oorspronkelijke basen worden hersteld
Het enzym bevat twee lichtgevoelige chromofoor-cofactoren:
o MTHF-derivaat (NTD-chromofoor)
o FAD/FADH⁻ (CTD-chromofoor)
Reactiestappen van fotolyase
1. Het MTHF-chromofoor absorbeert een foton blauw licht en wordt geactiveerd
2. De energie wordt doorgestuurd naar FADH, dat een elektron overdraagt aan het
dimeer (vorming van FADH°).
3. De ringstructuur van het dimeer wordt herschikt en verbroken.
4. Na herstel geeft het dimeer een elektron terug aan FADH°, waardoor FADH wordt
geregenereerd (=hersteld)
Licht- versus donkerherstel
Alle andere DNA-herstelsystemen zijn donkerherstelmechanismen, omdat ze geen
licht nodig hebben
De mens bezit geen fotolyase en gebruikt daarom nucleotide-excisieherstel (NER)
om pyrimidinedimeren en andere omvangrijke DNA-vervormingen te verwijderen
Base excisie herstel/repair (BER)
Doel van BER
Het Base Excisie Herstel (BER)-systeem repareert één enkele beschadigde of
gemodificeerde base of een a-basische plaats (AP-plaats)
o AP-plaatsen ontstaan o.a. door de ±20.000 spontane basenhydrolyses per
dag
BER is essentieel voor het herkennen van chemisch gemodificeerde basen, schade
door ROS, straling, cytostatica of andere afwijkingen die de DNA-duplex
vervormen
BER in E. coli
BER in E. coli gebruikt verschillende DNA-glycosylasen om specifieke
gemodificeerde basen te herkennen en te verwijderen. Het herstelt o.a.:
o Uracil (C → U deaminatie)
o Hypoxanthine (deaminatie van adenine)
o Gealkyleerde basen (bv. 3-methyladenine)
o Formamide-pyrimidine
, o 6,7-hydroxythymine
o Geoxideerde basen (bv. 8-oxy-guanine)
Voorbeeld: Herstel van een G–U basenpaar
Een U in DNA kan ontstaan door:
o Deaminatie van C → U waardoor een G-U mismatch ontstaat
o Foutieve inbouw tijdens replicatie (G-U of A-U ontstaan)
Ontsnapt aan proofreading
A-U mismatches worden hersteld door MMR (methyl-gestuurde mismatch herstel
systemen), en wordt G-U hersteld door BER
Reactiestappen van BER in E. coli
Uracil-glycosylase verwijdert U door de base uit de helix te draaien en de
β-glycosidische binding te hydrolyseren → AP-plaats ontstaat in de suiker-fosfaat
ruggengraat
o S-P-rest moet verwijderd worden
AP-endonuclease (a-nuclease) knipt vóór de AP-plaats → 3'-OH en 5'-P ontstaat
Kort pad (1 nucleotide):
o Fosfodiësterase verwijdert de suikerrest → er ontbreekt 1 nucleotide.
o DNA-pol I vult dit aan en DNA-ligase sluit de streng
Lang pad (meerdere nucleotiden):
o DNA-pol I voert nick translation uit
o Oude nucleotiden worden verwijderd, nieuwe ingebouwd
o DNA-ligase sluit de streng
→ herstel door BER-systeem voorkomt dat C → U deaminatie leidt tot mutaties
BER in de mens
Korte pad (dominant) – 1 nucleotide herstel
Wordt gebruikt in alle cellen, ook niet-delende
Gebruikt DNA-glycosylasen, AP-endonuclease, DNA-pol β, DNA-ligase III/XRCC1
Stappen:
1. Een specifiek DNA-glycosylase herkent en verwijdert de beschadigde base (mens
heeft 11 verschillende glycosylasen)
a. DNA-glycolase klieft de β-glycosidische binding tussen deoxyribose en
mismatched DNA-base → AP-plaats
2. AP-endonuclease knipt vóór de AP-plaats → 3'-OH + 5'dRP
3. DNA-pol β verwijdert de 5'dRP-structuur (lyase-activiteit)
4. DNA-pol β voegt één correcte nucleotide in
5. DNA-ligase III + XRCC1 sluiten de streng.
Lange pad (2–12 nucleotiden) – replicatiegebonden
Gebeurt in prolifererende cellen
Gebruikt DNA-pol δ/ε, PCNA, DNA-ligase I
Geactiveerd door glycosylasen zoals UNG2 en NEIL (hoog in S-fase)
Stappen:
1. Glycosylase verwijdert base → AP-plaats
2. AP-endonuclease knipt → 3'-OH en 5'dRP
3. DNA-pol β/δ/ε synthetiseren 2–12 nieuwe nucleotiden → flap-vorming
DNA-herstelmechanismen
Cellen beschikken over verschillende DNA-herstelmechanismen en ontsnappingsroutes
(zoals nonsense-mediated decay) om mutaties te herstellen en om beschadigde RNA- en
eiwitmoleculen te verwijderen.
De meeste herstelmechanismen werken volgens hetzelfde principe:
1. Het beschadigde DNA-segment wordt uit de dubbele helix verwijderd
2. DNA-polymerase vult de opening opnieuw op door gebruik te maken van de
complementaire streng als matrijs
3. DNA-ligase sluit het herstelde stuk aan door de fosfodiësterbrug te vormen
Bij bepaalde soorten schade, zoals interstreng crosslinks of dubbelstrengs breuken,
moeten beide DNA-strengen worden hersteld. Het verlies van deze mechanismen
verhoogt de kans op kanker.
In hogere eukaryoten bestaan meerdere DNA-polymerasen die essentieel zijn voor de
replicatie van het kern-DNA, naast gespecialiseerde polymerasen die betrokken zijn bij
herstel van beschadigd DNA.
Rol van de belangrijkste polymerasen
o DNA-polymerase α vormt samen met een primase een complex dat
RNA-primers aanmaakt voor de synthese van Okazaki-fragmenten aan de
lagging strand. Het verlengt deze primers kort met DNA-nucleotiden.
o Daarna nemen DNA-polymerase δ en DNA-polymerase ε de synthese over:
Pol ε: continue synthese van de leading strand
Pol δ: discontinue synthese van de lagging strand
o Beide polymerasen hebben 3'→5' exonuclease-activiteit voor proofreading
Okazaki-fragmenten zijn korter dan in prokaryoten
Belangrijke eiwitten in de replicatiemachine
o RFA (Replication Factor A): functioneert als SSB-eiwit, beschermt
enkelstrengs DNA
o PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen): de glijdende klem die het
polymerase aan het DNA houdt
o RFC (Replication Factor C): de klem-lader die PCNA op de primer-template
plaatst
Helicase en topoisomerase
o MCM2-7-complex, samen met CMG-complex (Cdc45, Mcm10, GINS), vormt
de helicase die de DNA-duplex ontwindt
o Topoisomerase I en II verwijderen torsiespanning (supercoils) aan de
replicatievork
Verwijderen van RNA-primers
o FEN1 maakt een knip tussen RNA-primer en nieuw DNA
o RNase H verwijdert de resterende RNA-primer
o DNA-polymerase δ vult het ontstane hiaat op
o DNA-ligase verbindt de Okazaki-fragmenten tot een continue streng
De proofreading functie van DNA-polymerase
,Tijdens de DNA-replicatie kunnen er foutieve basen ingebouwd worden. Het 3'→5'
exonuclease-proofreading systeem van het DNA-polymerase verwijderd deze foutieve
basen
Fotoreactieve herstel
Fotoreactivatie is een lichtafhankelijk DNA-herstelsysteem dat pyrimidine-dimeren (T-T,
C-C, C-T) en vergelijkbare helixvervormingen kan herstellen. Het komt voor in bacteriën
en sommige eukaryoten zoals wieren, maar niet in de mens.
Werkingsprincipe
Een DNA-fotolyase (gecodeerd door het phr-gen) herkent en bindt in het donker
aan een pyrimidine-dimeer
Bij blootstelling aan blauw licht (300–500 nm) wordt het enzym geactiveerd en
wordt de cyclobutaanring tussen de twee pyrimidinebasen verbroken, waardoor de
oorspronkelijke basen worden hersteld
Het enzym bevat twee lichtgevoelige chromofoor-cofactoren:
o MTHF-derivaat (NTD-chromofoor)
o FAD/FADH⁻ (CTD-chromofoor)
Reactiestappen van fotolyase
1. Het MTHF-chromofoor absorbeert een foton blauw licht en wordt geactiveerd
2. De energie wordt doorgestuurd naar FADH, dat een elektron overdraagt aan het
dimeer (vorming van FADH°).
3. De ringstructuur van het dimeer wordt herschikt en verbroken.
4. Na herstel geeft het dimeer een elektron terug aan FADH°, waardoor FADH wordt
geregenereerd (=hersteld)
Licht- versus donkerherstel
Alle andere DNA-herstelsystemen zijn donkerherstelmechanismen, omdat ze geen
licht nodig hebben
De mens bezit geen fotolyase en gebruikt daarom nucleotide-excisieherstel (NER)
om pyrimidinedimeren en andere omvangrijke DNA-vervormingen te verwijderen
Base excisie herstel/repair (BER)
Doel van BER
Het Base Excisie Herstel (BER)-systeem repareert één enkele beschadigde of
gemodificeerde base of een a-basische plaats (AP-plaats)
o AP-plaatsen ontstaan o.a. door de ±20.000 spontane basenhydrolyses per
dag
BER is essentieel voor het herkennen van chemisch gemodificeerde basen, schade
door ROS, straling, cytostatica of andere afwijkingen die de DNA-duplex
vervormen
BER in E. coli
BER in E. coli gebruikt verschillende DNA-glycosylasen om specifieke
gemodificeerde basen te herkennen en te verwijderen. Het herstelt o.a.:
o Uracil (C → U deaminatie)
o Hypoxanthine (deaminatie van adenine)
o Gealkyleerde basen (bv. 3-methyladenine)
o Formamide-pyrimidine
, o 6,7-hydroxythymine
o Geoxideerde basen (bv. 8-oxy-guanine)
Voorbeeld: Herstel van een G–U basenpaar
Een U in DNA kan ontstaan door:
o Deaminatie van C → U waardoor een G-U mismatch ontstaat
o Foutieve inbouw tijdens replicatie (G-U of A-U ontstaan)
Ontsnapt aan proofreading
A-U mismatches worden hersteld door MMR (methyl-gestuurde mismatch herstel
systemen), en wordt G-U hersteld door BER
Reactiestappen van BER in E. coli
Uracil-glycosylase verwijdert U door de base uit de helix te draaien en de
β-glycosidische binding te hydrolyseren → AP-plaats ontstaat in de suiker-fosfaat
ruggengraat
o S-P-rest moet verwijderd worden
AP-endonuclease (a-nuclease) knipt vóór de AP-plaats → 3'-OH en 5'-P ontstaat
Kort pad (1 nucleotide):
o Fosfodiësterase verwijdert de suikerrest → er ontbreekt 1 nucleotide.
o DNA-pol I vult dit aan en DNA-ligase sluit de streng
Lang pad (meerdere nucleotiden):
o DNA-pol I voert nick translation uit
o Oude nucleotiden worden verwijderd, nieuwe ingebouwd
o DNA-ligase sluit de streng
→ herstel door BER-systeem voorkomt dat C → U deaminatie leidt tot mutaties
BER in de mens
Korte pad (dominant) – 1 nucleotide herstel
Wordt gebruikt in alle cellen, ook niet-delende
Gebruikt DNA-glycosylasen, AP-endonuclease, DNA-pol β, DNA-ligase III/XRCC1
Stappen:
1. Een specifiek DNA-glycosylase herkent en verwijdert de beschadigde base (mens
heeft 11 verschillende glycosylasen)
a. DNA-glycolase klieft de β-glycosidische binding tussen deoxyribose en
mismatched DNA-base → AP-plaats
2. AP-endonuclease knipt vóór de AP-plaats → 3'-OH + 5'dRP
3. DNA-pol β verwijdert de 5'dRP-structuur (lyase-activiteit)
4. DNA-pol β voegt één correcte nucleotide in
5. DNA-ligase III + XRCC1 sluiten de streng.
Lange pad (2–12 nucleotiden) – replicatiegebonden
Gebeurt in prolifererende cellen
Gebruikt DNA-pol δ/ε, PCNA, DNA-ligase I
Geactiveerd door glycosylasen zoals UNG2 en NEIL (hoog in S-fase)
Stappen:
1. Glycosylase verwijdert base → AP-plaats
2. AP-endonuclease knipt → 3'-OH en 5'dRP
3. DNA-pol β/δ/ε synthetiseren 2–12 nieuwe nucleotiden → flap-vorming
