Demo LC-MS/MS
Deze demo hoort bij het practicum omtrent bepaling van mycotoxines in urine. In het kort
loopt dit practicum als volgt: een urinestaal wordt gehomogeniseerd en een deel van dit
staal wordt overgebracht in een extractiebuis. Aan de hoeveelheid staal in de extractiebuis
wordt vervolgens een extractiesolvent toegevoegd, waarna de buizen worden geschud en
gecentrifugeerd. We bekomen na centrifugatie twee fasen: een organische fase en een
waterige fase. De mycotoxines bevinden zich in de organische fase, die van de vloeistof
wordt “afgehaald” en daarna op hoge temperatuur wordt gezet zodat het extractiesolvent
verdampt. Hetgeen dat overblijft lossen we opnieuw op met injectiesolvent en we brengen
het in een HPLC-vial. De oplossing wordt vervolgens op de kolom gebracht, waar de
scheiding gebeurt en waarna er ook MS/MS detectie zal zijn.
1. De opstelling van LC-MS
HPLC zorgt voor scheiding van de componenten in het staal, de massaspectrometer zorgt
voor identificatie en detectie van de componenten in het staal. Alle resultaten worden
geregistreerd op de processor.
1
, Scheiding met HPLC
Met HPLC scheiden we de componenten op basis van hun polariteit en affiniteit voor de
stationaire fase. Bij dit experiment werken we met een C18-kolom, wat betekent dat we een
heel apolaire stationaire fase hebben en dat we een polaire mobiele fase hebben. Hoe
hydrofober de component, hoe meer affiniteit voor de stationaire fase en dus hoe langer de
retentietijd. De retentietijd is specifiek voor de component. We werken met een
gradiëntelutie, waarbij de samenstelling van de mobiele fase verandert in functie van de
tijd. We hebben een stijgend aandeel van organische fase doorheen de meting. Dit zorgt
voor een verandering in polariteit, wat zorgt voor scheiding. Na bepaalde tijd wordt terug
overgegaan naar de omstandigheden van het begin, zodat men zonder probleem kan
starten met de nieuwe meting.
Elke component die de HPLC-kolom verlaat, wordt naar de massaspectrometer geleid waar
ionisatie plaatsvindt.
Ionisatie
Bij het verlaten van de capillair naar de massaspectrometer komen de componenten in de
ionisatiebron, waar de componenten een lading krijgen. De ionen komen op de ‘cone’
terecht die een bepaalde spanning draagt. Afhankelijk van de spanning worden bepaalde
ionen naar binnen getrokken terwijl andere ionen op de cone achterblijven, wat zorgt voor
selectie. Door de capillairhouder blaast stikstofgas (N 2) die een nevel doet ontstaan die
zorgt voor verdampen van de mobiele fase. Er worden zo steeds kleinere druppels gevormd
tot enkel de aparte ionen overblijven. Dit proces noemen we electrospray ionisatie (ESI). De
ionen gaan vervolgens naar de massafilter.
Tijdens het tunen van de componenten zoekt men steeds naar de ideale spanningen
waarop de component het grootste signaal geeft. De spanningen zijn specifiek voor elke
component.
2
Deze demo hoort bij het practicum omtrent bepaling van mycotoxines in urine. In het kort
loopt dit practicum als volgt: een urinestaal wordt gehomogeniseerd en een deel van dit
staal wordt overgebracht in een extractiebuis. Aan de hoeveelheid staal in de extractiebuis
wordt vervolgens een extractiesolvent toegevoegd, waarna de buizen worden geschud en
gecentrifugeerd. We bekomen na centrifugatie twee fasen: een organische fase en een
waterige fase. De mycotoxines bevinden zich in de organische fase, die van de vloeistof
wordt “afgehaald” en daarna op hoge temperatuur wordt gezet zodat het extractiesolvent
verdampt. Hetgeen dat overblijft lossen we opnieuw op met injectiesolvent en we brengen
het in een HPLC-vial. De oplossing wordt vervolgens op de kolom gebracht, waar de
scheiding gebeurt en waarna er ook MS/MS detectie zal zijn.
1. De opstelling van LC-MS
HPLC zorgt voor scheiding van de componenten in het staal, de massaspectrometer zorgt
voor identificatie en detectie van de componenten in het staal. Alle resultaten worden
geregistreerd op de processor.
1
, Scheiding met HPLC
Met HPLC scheiden we de componenten op basis van hun polariteit en affiniteit voor de
stationaire fase. Bij dit experiment werken we met een C18-kolom, wat betekent dat we een
heel apolaire stationaire fase hebben en dat we een polaire mobiele fase hebben. Hoe
hydrofober de component, hoe meer affiniteit voor de stationaire fase en dus hoe langer de
retentietijd. De retentietijd is specifiek voor de component. We werken met een
gradiëntelutie, waarbij de samenstelling van de mobiele fase verandert in functie van de
tijd. We hebben een stijgend aandeel van organische fase doorheen de meting. Dit zorgt
voor een verandering in polariteit, wat zorgt voor scheiding. Na bepaalde tijd wordt terug
overgegaan naar de omstandigheden van het begin, zodat men zonder probleem kan
starten met de nieuwe meting.
Elke component die de HPLC-kolom verlaat, wordt naar de massaspectrometer geleid waar
ionisatie plaatsvindt.
Ionisatie
Bij het verlaten van de capillair naar de massaspectrometer komen de componenten in de
ionisatiebron, waar de componenten een lading krijgen. De ionen komen op de ‘cone’
terecht die een bepaalde spanning draagt. Afhankelijk van de spanning worden bepaalde
ionen naar binnen getrokken terwijl andere ionen op de cone achterblijven, wat zorgt voor
selectie. Door de capillairhouder blaast stikstofgas (N 2) die een nevel doet ontstaan die
zorgt voor verdampen van de mobiele fase. Er worden zo steeds kleinere druppels gevormd
tot enkel de aparte ionen overblijven. Dit proces noemen we electrospray ionisatie (ESI). De
ionen gaan vervolgens naar de massafilter.
Tijdens het tunen van de componenten zoekt men steeds naar de ideale spanningen
waarop de component het grootste signaal geeft. De spanningen zijn specifiek voor elke
component.
2
