Samenvatting nieuwe technieken en hun toepassingen

Nieuwe technieken en hun toepassingen
1. Single cell sequencing
 Single-Cell Genomics: 10x Genomics biedt oplossingen voor het analyseren van de
genetische informatie van individuele cellen. Dit helpt wetenschappers om de heterogeniteit
binnen celpopulaties beter te begrijpen en kan belangrijke inzichten bieden in ziekten zoals
kanker.


1.1. Vroeger vs nu
 Vroeger: biopt genomen  bulk analysis 
gemiddelde genexpressie van al de cellen werd
bepaald maar dit was nooit 100% enkel tumoraal
DNA  cellulaire heterogeniteit werd hierdoor
gemaskeerd
o Wel veel goedkoper
 Nu: cellen worden onderverdeeld  één cel
wordt geëxtraheerd  elk celtype vertoont een
andere genexpressie en zo kan je heterogeniteit
waarnemen (bepaalde celtypen kunnen reageren
op chemotherapie en andere niet)
o Veel duurder
o Aantal cellen dat je kan analyseren in beperkt


1.2. 10x genomics single cells
 Oil
 Cells + reagentia (voor RNA-extractie)
 Barcoded beads (barcodes zijn essentieel voor het identificeren van welke mRNA-moleculen
afkomstig zijn van welke cel)
o Elke beat is bedekt met 1000den unieke DNA-oligonucleotiden, die fungeren als
moleculaire barcodes
o Deze barcodes bestaan uit sequenties die specifiek zijn voor elke bead, waardoor elk
mRNA-molecuul dat ermee in contact komt, gelabeld kan worden met een unieke
identifier.
o De structuur van een typische oligonucleotide op een bead is als volgt:
 TruSeq Read 1: primer voor het sequencen
 Barcode sequentie (10x barcode): identificeert de bead (en daarmee de cel).
 UMI-sequentie (= unieke moleculaire identifier): markeert elk individueel
mRNA-molecuul.
 Poly-T sequentie: bindt aan de poly-A staart van mRNA.




1

,  Individuele cellen worden samen met individuele beads in kleine druppeltjes van olie en
water gedaan  hierdoor ontstaat een emulsie en elke cel bevat meestal één cel en één
bead
 Binnen elk druppeltje wordt de cel gelyseerd  mRNA komt vrij
o De oligonucleotiden op de beads bevatten naast de unieke barcode ook een poly-T-
sequentie, die bindt aan de poly-A-staart van het mRNA.
 mRNA-moleculen worden gebruikt als sjablonen voor de synthese van complementair DNA
(cDNA). Tijdens deze cDNA-synthese worden de unieke barcodes van de beads aan het cDNA
gekoppeld. Dit proces wordt soms "in-droplet reverse transcription" genoemd.
o Dit is een PCR-stap
 Olie wordt verwijderd en cDNA-bibliotheken van alle druppels samengevoegd  door de 10x
beads weet je welk mRNA molecule bij welke bead hoort en dus bij welke cel hoort
 10000 cellen per kolom  80000 genexpressies kunnen gemeten worden van 80000 cellen

 Als we een PCR doen gaan er ook PCR duplicaten ontstaan, we weten dat er soms een bias
kan optreden tijdens PCR zoals dat kleine fragmenten makkelijker amplificeren en er kunnen
artefacten ontstaan, daardoor is het moeilijk te zeggen welke genen veel aanwezig waren en
welke weinig.
o Door de UMI codes kan dit bekeken worden. Wanneer er veel verschillende UMI
codes zijn voor één RNA molecule => hoge expressie.
o Wanneer steeds dezelfde UMI code gezien wordt voor hetzelfde RNA molecule =>
PCR duplicaat




 Met Illumina sequencing  kijken of er bepaalde clusters zijn in mijn populatie en zien of je
die kan gaan scheiden van elkaar  cellen met soortgelijke mRNA expressie
o Verschillende clusters terugkoppelen aan bepaalde celtypen

1.2.1. Toepassingen (dia 13-16)
 Tumorheterogeniteit in kaart brengen
 Nieuwe pathways zoeken die leiden tot therapie resistentie




2

, 2. Spatial genomics
 Single cell RNA sequencing laat toe om transcriptoom profielen van een cel te bepalen
 Spatial genomics laat toe om o.b.v. een slide  genexpressies bepalen van cellen die op de
slide liggen (dus op weefsels) en je kan die ook correleren met de positie van de slide


2.1. 10x genomics spatial gene expression HD Visium
 Slide  verschillende secties  op de
secties is het de bedoeling dat je tissue slide
legt
 Patholoog gaat naar slides kijken
 RNA sequencing library maken obv de slides
 barcoding and library construction maken
die we dan kunnen sequencen
 Resultaten terug correleren op de positie van
de cellen die op die slide lagen  stap
verder dan single cell sequencing (geen idee waar cellen op slide zich bevonden)
 Gebruik maken van 10X software tools om te kijken waar RNA expressie profielen zich
bevinden op slide
 Gebruik maken van scripts die op internet staan bv in R

2.1.1. High resolutie
 Barcoded spots  bestaan eigenlijk ter plaatsen waar de verschillende oligonucleotiden op
glazen plaat gecoat zijn  verschillende kleuren
o Capture plaats bestaat ongeveer uit 5000 barcoded spots
o Een spot ligt van middenpunt tot middenpunt van elkaar op 100m
o Een spot zelf is 55m
 Het kan dus zijn dat er verschillende cellen op zo’n 1 spot gecapteerd wordt
(nadeel: niet echt single cell  resolutie is niet echt single cell want
verschillende cellen per spot)
 Structuur oligonucleotiden
o Read primer
o Spatial barcode  bestaat uit 16 nt (uniek voor elke plaats op de array)  nodig om
terug te gaan naar bepaalde locatie op de spot
o UMI  onderscheidt maken tussen gene die hoog tot expressie komen of genen die
door PCR bias te veel geamplificeerd zijn
o Poly(dT) staart om RNA te capteren
 Het protocol werkt op fresh frozen tissues
o Voordeel: hoogste kwaliteit, mRNA moleculen ondervinden sneller degradatie dan
gDNA
 FFPE weefsel: belangrijk in kankeronderzoek  weefsel in formaline, bepaalde degradatie in
functie van de tijd
 Protocol tussen fresh frozen tissues en FFPE weefsel is verschillend
o Uit FFPE weefsel toch voldoende kwalitatief RNA te extraheren
Wat laat deze techniek ons nu toe?
 Kijken naar heel het transcriptoom

1. Sample prep
2. Weefsel op slide


3

, 3. Kijken door patholoog
4. H&E kleuring
o Formalin gefixeerd weefsel verkiezen omdat H&E kleuring en het snijden van weefsel
zoveel beter is  je kan onderscheid maken tussen fresh frozen tissues (als je daar
stukken van gaat snijden met microtoom, het heeft nogal de neiging om op te vouwen 
artefacten en dat heb je minder met FFPE) en FFPE tissues
5. Probe hybridisatie
6. Ligeren
7. Probe extensie doen om library te krijgen die we gaan sequencen en met software kunnen gaan
bekijken

2.1.2. 10x genomics visium RNA on FFPE slides?
2.1.2.1. RNA quality assessment
 Kijken of RNA goed van kwaliteit is
 Je kan niet zomaar eender welk FFPE weefsel krijgen
 Maat: DV200 score  maat van RNA fragmenten die groter zijn dan 200 nt  % van totale
RNA fragmenten die groter zijn dan 200 nt

2.1.2.2. Required equipment
 Microtome: slides maken van paraffine blok  stukjes snijden van FFPE weefsel
o Dikte kan je instellen  meestal 10 m
 Digital water bath
 Section dryer oven, hotplate or thermal cycler

2.1.2.3. Preparing the sample for sectioning
 Facing and scoring
 Paraffine blokje uit vriezer  bruin vlekje is weefsel waarover het gaat

2.1.2.4. Tissue placement and handling
 Weefsel tussen randen van array = fiducial border  aflijning dat herkent wordt door
apparaat en als je daartussen zit dan weet je dat over tussen de fiducial borders de spots
zitten en daar kan RNA expressie van bepaalt worden, daarbuiten zitten geen spots

2.1.3. Protocol
1) Deparaffinization and rehydration
o Paraffine oplossen door verschillende baden te gebruiken  xyleen (paar keer) en
dan wassen met ethanol  deparaffiniseren
o Rehydrateren met MilliQ water



2) H&E kleuring
o Hematoxilin eosine kleuring  karakteristieke beeld verkrijgen die door patholoog
bekeken kan worden
o Niet hetzelfde protocol als bij fresh frozen tissues

2.1.4. Moleculaire protocol
1) Visium for FFPE workflow and stopping points


4