Samenvatting iPSC-CM modellen in cardiologie

iPSC-CM modellen in cardiologie (Prof.
Alaerts)
1. iPSC-generatie
1.1. iPSC
 Onbeperkt vermogen tot zelfvernieuwing
 Kan differentiëren tot elk type volwassen cel
 Geïnduceerd: uit gedifferentieerde somatische cellen




 Pluripotente stamcellen omzetten tot eender welke cellen omzetten
 Bij cardiologie omzetten naar cardiomyocyten
 Cellen van patiënt  compound screening
 Kijken welk zal werken voor de patiënt
 CRISPR/Cas mutatie verbeteren
 Isogene lijn vergelijken
o Enkel de mutatie is hier dan een vershil


1.2. iPSC-generatie
 Start: kweek van somatische cellen
o Huidfibroblasten
o PBMC's: WBC of cellen uit urine
o Overige
 Herprogrammering met behulp van transcriptiefactoren
o Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc


1

, o “CytoTune iPS”-kit: transductie met niet-integrerende Sendai-
virusvectoren
 Protocol
o Beginnen met PBMC’s
o Dag 0 transductie
o Medium vervangen naar stamcelmedium
o Regelmatig medium veranderen en zien dat je meerdere kolonies
gaat vormen
 Fibroblasten die kleiner worden = dedifferentiëren
 Kolonie picking


1.3. iPSC-validatie
 Immunokleuring, flowcytometrie en/of qPCR van pluripotentiemarkers
 Potentieel om te differentiëren in 3 kiemlagen: gerichte differentiatie naar
endoderm, mesoderm en ectoderm
 Zijn het goede iPSCs
 Merkers voor pluripotentie
 OCT3 en 4 zijn TF dus bevinden zich in de kern van de cellen
 Verschillende pluripotentiefactoren tot expressie brengen is een goede
pluripotente cel
 Factoren toevoegen die je cellen doen veranderen naar bv endoderm
cellen, ectoderm cellen of mesoderm cellen  kiemlagen
o Van kiemlagen naar eender welk type cel




2. Differentiatie tot cardiomyocyten
 Goede iPSC dan verder gaan
 Om de 3 dagen extra doen groeien  groeien heel snel




2

,2.1. Differentiatie tot iPSC-CM
 iPSC  richting mesoderm  induceerd Wnt pathway  pathway stoppen
met Wnt-C59 voor 2 dagen  cellen veranderen  cardiomyocyten 
rond dag 8 cellen beginnen kloppen
 Hoe ouder cellen worden, hoe moeilijk het is om ze terug uit elkaar te
houden
 Uit elkaar halen en invriezen om ze terug te kunnen gebruiken
 Rond dag 30-40 pas echt de functie bekijken van de cardiomyocyten




2.2. iPSC-CM validatie
 Immunokleuring en/of qPCR van CM-specifieke markers
o Kijken naar merkers van cardiomyocyten
o Sarcomeren
o qPCR voor specifieke merkers  ionenkanalen en structurele
eiwitten
o Goed tot expressie dan heb je goede cellen gemaakt




2.3. iPSC-CM opmerkingen
 Verschillende soorten cardiomyocyten!
o Verschillende protocols om verschillende cardiomyocyten te maken
o Andere soorten groeifactoren toevoegen bijvoorbeeld
o Cellen immatuur
 Foetale CM's: Klopt jaren mooi samen en dit moet op 40 dagen dus eerder
foetale hartcel
o Structureel: ongeorganiseerde sarcomeren, onvolgroeide
ultrastructuur zonder t-tubuli.
o Elektrofysiologische verschillen met natuurlijke CM's: RMP minder
negatief (spontane hartslag), trage opwaartse AP, lagere dichtheid
van K+-stromen.
 Cellen meer doen matureren via
o Electrisch stimuleren

3

, o Mechanisch door ze mee te rekken
o Debris hormoon en vetzuren toevoegen

2.4. 3D
2.4.1.Cardiale ‘organoiden’
 Organoids maken = 3D orgaan
 Sterkte bepalen/contractiliteit
 Weefsel nabootsen
 Kleine druppels vol hartspiercellen
 Toekomst is om een heel hart te maken

2.4.2.EHT = Engineered heart tissue
 Gel maken van varkenshart en hierin
cardiomyocyten laten groeien in bepaalde structuur




2.4.3.Cardiale microweefsels
 Endotheelcellen en cardiale fibroblasten  samenvoegen en je krijgt
weefsel dat op hart lijkt
 Klein voor high thoughput
 Meer fysiologisch systeem door al deze dingen samen te voegen
 Cardiomyocyten zijn matuurder




4