Introductie
Receptorbindingstudies bepalen:
de affiniteit van geneesmiddelen voor receptoren
de bindingsplaatsdichtheid (Bmax) in verschillende weefsels
Doel:
inzicht krijgen in therapeutische of schadelijke effecten van stoffen op receptor-
subtypen
verdeling van receptoren in het lichaam in kaart brengen
effect van fysiologische en pathologische omstandigheden op receptor-expressie
analyseren
Twee hoofdtypen experimenten:
Saturatie-experimenten: meten affiniteit (1/Kd) van radioactieve liganden voor
een receptor en
Bmax van de receptor in specifieke weefsels
Competitie-experimenten: meten affiniteit (1/Ki) van niet-gemerkte liganden
voor een receptor
Resultaat:
identificatie van receptor-subtypen via correlatieplots van pK i-waarden
Basisconcept in receptor binding studies
Een receptorbindingstudie onderzoekt hoe een ligand (L) bindt aan een receptor (R) om
een ligand-receptorcomplex (LR) te vormen.
Bound = hoeveelheid ligand die aan de receptor is gebonden.
Free = hoeveelheid ligand (L) die vrij is en nog kan binden aan de receptor.
De gemeten waarde is de hoeveelheid radioactieve ligand die aan de receptor is
gebonden.
Essentiëel om vrije ligand van het gebonden ligand te scheiden zodra evenwicht
(steady-state) bereikt is.
Kd:
- meet de affiniteit van een ligand voor een receptor
- berekend als k₂/k₁ (dissociatie-/associatiesnelheid)
- is de ligandconcentratie waarbij 50% van de receptoren is bezet
Bmax:
- meet de receptorendichtheid in een weefsel
- komt overeen met de maximale hoeveelheid gebonden ligand bij volledige
receptorverzadiging
Analyseformules gaan uit van het hierboven beschreven bindingsmodel.
, Basisstappen in receptor bindingstudies
Binding van radioactieve ligand aan de receptor
De bron van de receptor kan bestaan uit: - celmembranen
- intacte cellen
- plakjes orgaanweefsel
- oplosbare receptorvoorbereiding
Het is belangrijk om deze voorbereiding te wassen om endogene liganden en
andere kleine moleculen te verwijderen die de binding vd radioactieve ligand ad
receptor kunnen verstoren.
De gebruikte radioactieve ligand moet:
hoge affiniteit hebben (in nanomolaire bereik / beter) vr de
onderzochte receptor
lage affiniteit hebben voor andere receptoren
hoge specifieke radioactiviteit bezitten (doorgaans 30 Ci/mmol of
hoger).
Radioactieve liganden zijn meestal antagonisten, omdat die doorgaans een
hogere affiniteit voor receptoren hebben dan agonisten. De radioactieve isotoop
is meestal - waterstof-3 (³H)
- jodium-125 (¹²⁵I)
De hoeveelheid receptorvoorbereiding in een assay hangt af van:
de affiniteit van de radioligand
de specifieke activiteit van de radioligand
en de dichtheid van de receptor in het weefsel
Ideaal gezien moet bij de laagste radioligandconcentratie tussen 100 en 500
counts per minute (cpm) aan de receptor worden gebonden. Dit kan worden
bereikt door:
de hoeveelheid weefsel (en dus receptor) te verhogen
radioligand met hogere specifieke activiteit te gebruiken, bv. ¹²⁵I-
gemerkte ligand
Minder dan 10% van de radioligand mag binden aan het weefsel, omdat de
analyse van saturatie-experimenten ervan uitgaat dat de vrije ligandconcentratie
constant blijft.
Het weefsel wordt geïncubeerd met de radioactieve ligand tot het evenwicht
(steady-state) is bereikt. Dit kan enkele minuten tot uren duren. De incubatie kan
plaatsvinden op ijs, bij kamertemperatuur of bij 37°C, afhankelijk van de
stabiliteit van de ligand en het weefsel. De affiniteit van de receptor voor de
ligand kan afhankelijk zijn van de temperatuur. De voorkeurstemperatuur is
meestal 22–25°C (kamertemperatuur).
Receptorbindingstudies bepalen:
de affiniteit van geneesmiddelen voor receptoren
de bindingsplaatsdichtheid (Bmax) in verschillende weefsels
Doel:
inzicht krijgen in therapeutische of schadelijke effecten van stoffen op receptor-
subtypen
verdeling van receptoren in het lichaam in kaart brengen
effect van fysiologische en pathologische omstandigheden op receptor-expressie
analyseren
Twee hoofdtypen experimenten:
Saturatie-experimenten: meten affiniteit (1/Kd) van radioactieve liganden voor
een receptor en
Bmax van de receptor in specifieke weefsels
Competitie-experimenten: meten affiniteit (1/Ki) van niet-gemerkte liganden
voor een receptor
Resultaat:
identificatie van receptor-subtypen via correlatieplots van pK i-waarden
Basisconcept in receptor binding studies
Een receptorbindingstudie onderzoekt hoe een ligand (L) bindt aan een receptor (R) om
een ligand-receptorcomplex (LR) te vormen.
Bound = hoeveelheid ligand die aan de receptor is gebonden.
Free = hoeveelheid ligand (L) die vrij is en nog kan binden aan de receptor.
De gemeten waarde is de hoeveelheid radioactieve ligand die aan de receptor is
gebonden.
Essentiëel om vrije ligand van het gebonden ligand te scheiden zodra evenwicht
(steady-state) bereikt is.
Kd:
- meet de affiniteit van een ligand voor een receptor
- berekend als k₂/k₁ (dissociatie-/associatiesnelheid)
- is de ligandconcentratie waarbij 50% van de receptoren is bezet
Bmax:
- meet de receptorendichtheid in een weefsel
- komt overeen met de maximale hoeveelheid gebonden ligand bij volledige
receptorverzadiging
Analyseformules gaan uit van het hierboven beschreven bindingsmodel.
, Basisstappen in receptor bindingstudies
Binding van radioactieve ligand aan de receptor
De bron van de receptor kan bestaan uit: - celmembranen
- intacte cellen
- plakjes orgaanweefsel
- oplosbare receptorvoorbereiding
Het is belangrijk om deze voorbereiding te wassen om endogene liganden en
andere kleine moleculen te verwijderen die de binding vd radioactieve ligand ad
receptor kunnen verstoren.
De gebruikte radioactieve ligand moet:
hoge affiniteit hebben (in nanomolaire bereik / beter) vr de
onderzochte receptor
lage affiniteit hebben voor andere receptoren
hoge specifieke radioactiviteit bezitten (doorgaans 30 Ci/mmol of
hoger).
Radioactieve liganden zijn meestal antagonisten, omdat die doorgaans een
hogere affiniteit voor receptoren hebben dan agonisten. De radioactieve isotoop
is meestal - waterstof-3 (³H)
- jodium-125 (¹²⁵I)
De hoeveelheid receptorvoorbereiding in een assay hangt af van:
de affiniteit van de radioligand
de specifieke activiteit van de radioligand
en de dichtheid van de receptor in het weefsel
Ideaal gezien moet bij de laagste radioligandconcentratie tussen 100 en 500
counts per minute (cpm) aan de receptor worden gebonden. Dit kan worden
bereikt door:
de hoeveelheid weefsel (en dus receptor) te verhogen
radioligand met hogere specifieke activiteit te gebruiken, bv. ¹²⁵I-
gemerkte ligand
Minder dan 10% van de radioligand mag binden aan het weefsel, omdat de
analyse van saturatie-experimenten ervan uitgaat dat de vrije ligandconcentratie
constant blijft.
Het weefsel wordt geïncubeerd met de radioactieve ligand tot het evenwicht
(steady-state) is bereikt. Dit kan enkele minuten tot uren duren. De incubatie kan
plaatsvinden op ijs, bij kamertemperatuur of bij 37°C, afhankelijk van de
stabiliteit van de ligand en het weefsel. De affiniteit van de receptor voor de
ligand kan afhankelijk zijn van de temperatuur. De voorkeurstemperatuur is
meestal 22–25°C (kamertemperatuur).
