Examen practicum
pDNA
Doel: opzuivering en identificatie van DNA
DNA: Hierin ligt erfelijke informatie opgeslagen, het bestaat uit twee lange ketens van nucleotiden,
die in de vorm van een dubbele helix met elkaar verbonden zijn via waterstofbruggen.
nucleobasen => adenine, cytosine, guanine en thymine
=> volgorde bepaalt welk eiwit gevormd wordt
pDNA: Cirkelvormige dubbele streng DNA, buiten chromosomaal DNA. 1000 – 200 000 baseparen.
Hierdoor kan genetische informatie tussen bacteriën worden uitgewisseld.
=> Plasmiden dragen altijd minstens 1 gen => vaak gunstig voor ontvangende bacterie
=> Plasmiden kunnen onafhankelijk repliceren; bevat origin of replication
=> Plasmide in labo wordt gemaakt bevat selectiemarker: resistentie gen tegen antibioticum
=> gebruikt om genetische modificaties uit te voeren => gewenste eign aan cel toevoegen
GENTHERAPIE!
restrictie-enzymen: Enzym dat een specifieke DNA-sequentie herkent (= recognition site) en hier knipt
=> op geknipte plaats een ander stuk DNA toevoegen => recombinant DNA
Vermeerderen: gewenste plasmide verkregen => opkweken in bacteriën
bacteriën gekweekt en behandeld met antibioticum; overlevende bacteria
bevatten gewenste plasmide met antibioticum resistentie!
Lyseer die bacteriën om plasmiden te isoleren en zuiver DNA op
principe opzuivering supernatans: opzuiveringsstappen: 1) bacterieën lyseren om DNA te isoleren
2) binden van het DNA aan de silica-kolom
3) was-stappen om onzuiverheden weg te wassen
4) elutie van het DNA van de kolom
Lyse: plasmide bevindt zich in bacterie; plasmide isoleren mbv lysis buffer
=> buffer bevat enzymen die celwand kapot maken
=> grote celresten = PELLET, scheiden van macromoleculen = SUPERNATANS
Binden silica-kolom: breng supernatans op silica kolom => beide negatief lading
=> DNA NIET afgestoten door silica door lage pH oplossing
met hoge zoutconcentratie = toch binding DNA en silica
Wasstappen: was geheel met zout/ethanol-oplossing; verwijdert onzuiverheden
zoals eiwitten, overtollige zouten… terwijl pDNA gebonden blijft
=> was 2 keer
Elutie: breng elutiebuffer op silica-kolom; heeft hoge pH en lage zout concentratie
=> negatieve lading van silica en DNA niet meer afgeschermd
=> pDNA komt los van kolom tijdens centrifugatie
=> pDNA bevindt zich in ELUENS
gehaltebepaling pDNA: eluens bevat onbekende hoeveelheid pDNA
=> gekend: DNA heeft absorbantiemaximum van 260 nm => bepaal c met UV / VIS
=> onzuiverheden hebben andere absorbantie: zouten ( 230 nm), eiwitten ( 280 nm)
, met A = absorbantie; ε = extinctie coëfficiënt; c = concentratie; I = lengte
Beer-Lamberts wet: Er is een lineaire relatie tussen concentratie en de absorbantie van de oplossing,
wat ervoor zorgt dat de concentratie van een oplossing kan berekend worden
door meting van de absorbantie.
Nanodrop measurement: 1 nanoliter DNA oplossing nodig om de concentratiezuiverheid te bepalen
=> A (= eiwit onzuiverheid uitsluiten als verhouding tussen 2,1 - 1,8)
=> A (= eiwit en zout onzuiverheden; verhouding moet bij 2 liggen)
principe gelelectroforese: 1) maak gel: agarose oplossen in buffer, door te verwarmen
voeg Gelred toe; kleurstof die aan DNA bindt voor fluorescentie
giet oplossing in gelhouder ( laantjes stalen) , wacht tot solidificatie
2) laden van gel: pippeteer DNA ladder en stalen in gel
3) lopen van gel: sluit elektroden aan; gel onder constant voltage 40 min – 1,5 u
negatief geladen DNA migreert van neg naar pos elektrode
kleinere fragmenten migreren sneller!
4) UV – detectie: na lopen van gel detecteer je DNA-bandjes mbv UV-licht
ladder (= links) is referentie; helpt bij identificatie groottes DNA
PCR
DNA-fingerprint = DNA profiel, genetische vingerafdruk; uniek voor elke persoon
=> vergelijk bekomen DNA profiel met DNA profiel van verdachte
Menselijk DNA: Komt voor in - de celkern (= nucleair/ genomisch DNA; uit chromosomen; uniek)
- het cytosol = cytoplasma (= in mitochondriën; zelfde in de maternale lijn)
Genomisch DNA: - coderend DNA (= genetische informatie + fenotype kenm; coderen voor eiwitten)
- niet-coderend DNA (= ‘extra-genetisch’; grootste deel van genoom; geen
fenotypische kenmerken)
In forensisch onderzoek: analyseer JUNK DNA; zoek geen targets die info geven over uiterlijk, maar
zoek targets die sterk verschillen tussen individuen!
!! bepaal WEL geslacht tijdens forensisch DNA-onderzoek
STRs: Short Tandem Repeats = identieke, repetitieve units van 2 – 6 baseparen lang
=> Forensisch: vaak onderzoek van tetranucleotide repeats (= 4 baseparen) via STR-merkers
=> Voordeel: STR-regio’s zijn kleine fragmenten 100 – 500 baseparen, voordeel bij afgebroken staal
=> zeer polymorf = aantal herhalingen is verschillend voor elke persoon
!! DNA breekt snel af bv. Door te lang in de zon te liggen
!! aantal repeats bepaalt de lengte van allel
Er bestaan verschillende STR merkers
Selecteer merkers die ver van elkaar liggen in genoom
(= liefst op verschillende chormosomen, worden onafhankelijk van elkaar doorgegeven)
Geslacht wordt bepaald met Amelogenine merker op X en Y chromosoom
Locus: De plaats op het genoom waar de merker zich bevindt. Bv. Op chromosoom … op positie … - …
, Allel: Dit is de variant van de merker en slaat op het aantal repeats => Het aantal repeats van de merker
Heterozygoot: Als je twee keer een verschillend aantal repeats hebt voor dezelfde STR-locus = een
verschillend allel op beide chromosomen
Homozygoot: Als je twee keer hetzelfde aantal repeats hebt voor dezelfde STR-locus = hetzelfde allel op
beide chromosomen
DNA-profiel: elke merker heeft verschillende allelen + er zijn verschillende merkers!
=> bereken kans dat allel voorkomt van 1 merker * aantal merkers die we onderzoeken
= kans die groter is dan de wereldbevolking!
elk DNA-profiel is uniek!! Behalve eeneiige tweelingen
Proef: Doelstelling is om een DNA-profiel zelf op te stellen
=> Cellen losweken van de dragger en DNA extraheren uit de cel mbv Chelex
=> DNA amplificatie adv PCR om te kunnen detecteren
=> Detectie van DNA-fragmenten mbv capillaire electroforese
=> Bekomen profielen analyseren adv allelen
Stappenplan:
DNA extractie: - gebruik Chelex => hars dat ionen capteert, zodat er minder ionen in oplossing zitten
=> door osmotische kracht zal cel water opnemen
=> concentratie ionen daalt, concentratie ionen buiten stijgt = gelijk
=> cel barst door osmotische druk (= zachte lyse en harde lyse)
Zachte lyse: 56°C zodat osmose werk kan doen
Harde lyse: bij kooktemp, zodat alle cellen barsten en
DNA vrij + denaturatie van afbraakeiwitten
=> bescherming DNA tegen DNasen (= breken DNA af)
- centrifugeren van DNA => DNA zit opgelost in supernatans
=> het pellet bestaat uit Chelex; mag niet in PCR reactie!
DNA-amplificatie met PCR: - in vitro techniek die DNA repliceert
- gebruikt Taq polymerase enzym (= bindt enkel op dubbelstrengig DNA)
- Taq = Thermus aquaticus (= van organisme dat in warmwater bronnen
leeft en kooktemperaturen overleeft!
Dit polymerase zal niet denatureren tijdens
temperatuursverhoging van PCR)
- gebruik ENKELSTRENGIG DNA als template voor synthese
- PRIMER nodig om PCR reactie te starten (= dubbelstrengig)
- verschillende cycli: denaturatie, annealing en elongatie
PCR: 1) Denaturatie = van dubbelstrengig DNA, twee enkelstrengige DNA ketens maken
=> verhit kort tot 95°C om alle H-bruggen te verbreken
2) Annealing = aanhechten van primer aan het template DNA (= enkelstrengig)
=> verlaag temperatuur!! Hoeveel verlagen hangt af van Tm (= smelttemperatuur)
pDNA
Doel: opzuivering en identificatie van DNA
DNA: Hierin ligt erfelijke informatie opgeslagen, het bestaat uit twee lange ketens van nucleotiden,
die in de vorm van een dubbele helix met elkaar verbonden zijn via waterstofbruggen.
nucleobasen => adenine, cytosine, guanine en thymine
=> volgorde bepaalt welk eiwit gevormd wordt
pDNA: Cirkelvormige dubbele streng DNA, buiten chromosomaal DNA. 1000 – 200 000 baseparen.
Hierdoor kan genetische informatie tussen bacteriën worden uitgewisseld.
=> Plasmiden dragen altijd minstens 1 gen => vaak gunstig voor ontvangende bacterie
=> Plasmiden kunnen onafhankelijk repliceren; bevat origin of replication
=> Plasmide in labo wordt gemaakt bevat selectiemarker: resistentie gen tegen antibioticum
=> gebruikt om genetische modificaties uit te voeren => gewenste eign aan cel toevoegen
GENTHERAPIE!
restrictie-enzymen: Enzym dat een specifieke DNA-sequentie herkent (= recognition site) en hier knipt
=> op geknipte plaats een ander stuk DNA toevoegen => recombinant DNA
Vermeerderen: gewenste plasmide verkregen => opkweken in bacteriën
bacteriën gekweekt en behandeld met antibioticum; overlevende bacteria
bevatten gewenste plasmide met antibioticum resistentie!
Lyseer die bacteriën om plasmiden te isoleren en zuiver DNA op
principe opzuivering supernatans: opzuiveringsstappen: 1) bacterieën lyseren om DNA te isoleren
2) binden van het DNA aan de silica-kolom
3) was-stappen om onzuiverheden weg te wassen
4) elutie van het DNA van de kolom
Lyse: plasmide bevindt zich in bacterie; plasmide isoleren mbv lysis buffer
=> buffer bevat enzymen die celwand kapot maken
=> grote celresten = PELLET, scheiden van macromoleculen = SUPERNATANS
Binden silica-kolom: breng supernatans op silica kolom => beide negatief lading
=> DNA NIET afgestoten door silica door lage pH oplossing
met hoge zoutconcentratie = toch binding DNA en silica
Wasstappen: was geheel met zout/ethanol-oplossing; verwijdert onzuiverheden
zoals eiwitten, overtollige zouten… terwijl pDNA gebonden blijft
=> was 2 keer
Elutie: breng elutiebuffer op silica-kolom; heeft hoge pH en lage zout concentratie
=> negatieve lading van silica en DNA niet meer afgeschermd
=> pDNA komt los van kolom tijdens centrifugatie
=> pDNA bevindt zich in ELUENS
gehaltebepaling pDNA: eluens bevat onbekende hoeveelheid pDNA
=> gekend: DNA heeft absorbantiemaximum van 260 nm => bepaal c met UV / VIS
=> onzuiverheden hebben andere absorbantie: zouten ( 230 nm), eiwitten ( 280 nm)
, met A = absorbantie; ε = extinctie coëfficiënt; c = concentratie; I = lengte
Beer-Lamberts wet: Er is een lineaire relatie tussen concentratie en de absorbantie van de oplossing,
wat ervoor zorgt dat de concentratie van een oplossing kan berekend worden
door meting van de absorbantie.
Nanodrop measurement: 1 nanoliter DNA oplossing nodig om de concentratiezuiverheid te bepalen
=> A (= eiwit onzuiverheid uitsluiten als verhouding tussen 2,1 - 1,8)
=> A (= eiwit en zout onzuiverheden; verhouding moet bij 2 liggen)
principe gelelectroforese: 1) maak gel: agarose oplossen in buffer, door te verwarmen
voeg Gelred toe; kleurstof die aan DNA bindt voor fluorescentie
giet oplossing in gelhouder ( laantjes stalen) , wacht tot solidificatie
2) laden van gel: pippeteer DNA ladder en stalen in gel
3) lopen van gel: sluit elektroden aan; gel onder constant voltage 40 min – 1,5 u
negatief geladen DNA migreert van neg naar pos elektrode
kleinere fragmenten migreren sneller!
4) UV – detectie: na lopen van gel detecteer je DNA-bandjes mbv UV-licht
ladder (= links) is referentie; helpt bij identificatie groottes DNA
PCR
DNA-fingerprint = DNA profiel, genetische vingerafdruk; uniek voor elke persoon
=> vergelijk bekomen DNA profiel met DNA profiel van verdachte
Menselijk DNA: Komt voor in - de celkern (= nucleair/ genomisch DNA; uit chromosomen; uniek)
- het cytosol = cytoplasma (= in mitochondriën; zelfde in de maternale lijn)
Genomisch DNA: - coderend DNA (= genetische informatie + fenotype kenm; coderen voor eiwitten)
- niet-coderend DNA (= ‘extra-genetisch’; grootste deel van genoom; geen
fenotypische kenmerken)
In forensisch onderzoek: analyseer JUNK DNA; zoek geen targets die info geven over uiterlijk, maar
zoek targets die sterk verschillen tussen individuen!
!! bepaal WEL geslacht tijdens forensisch DNA-onderzoek
STRs: Short Tandem Repeats = identieke, repetitieve units van 2 – 6 baseparen lang
=> Forensisch: vaak onderzoek van tetranucleotide repeats (= 4 baseparen) via STR-merkers
=> Voordeel: STR-regio’s zijn kleine fragmenten 100 – 500 baseparen, voordeel bij afgebroken staal
=> zeer polymorf = aantal herhalingen is verschillend voor elke persoon
!! DNA breekt snel af bv. Door te lang in de zon te liggen
!! aantal repeats bepaalt de lengte van allel
Er bestaan verschillende STR merkers
Selecteer merkers die ver van elkaar liggen in genoom
(= liefst op verschillende chormosomen, worden onafhankelijk van elkaar doorgegeven)
Geslacht wordt bepaald met Amelogenine merker op X en Y chromosoom
Locus: De plaats op het genoom waar de merker zich bevindt. Bv. Op chromosoom … op positie … - …
, Allel: Dit is de variant van de merker en slaat op het aantal repeats => Het aantal repeats van de merker
Heterozygoot: Als je twee keer een verschillend aantal repeats hebt voor dezelfde STR-locus = een
verschillend allel op beide chromosomen
Homozygoot: Als je twee keer hetzelfde aantal repeats hebt voor dezelfde STR-locus = hetzelfde allel op
beide chromosomen
DNA-profiel: elke merker heeft verschillende allelen + er zijn verschillende merkers!
=> bereken kans dat allel voorkomt van 1 merker * aantal merkers die we onderzoeken
= kans die groter is dan de wereldbevolking!
elk DNA-profiel is uniek!! Behalve eeneiige tweelingen
Proef: Doelstelling is om een DNA-profiel zelf op te stellen
=> Cellen losweken van de dragger en DNA extraheren uit de cel mbv Chelex
=> DNA amplificatie adv PCR om te kunnen detecteren
=> Detectie van DNA-fragmenten mbv capillaire electroforese
=> Bekomen profielen analyseren adv allelen
Stappenplan:
DNA extractie: - gebruik Chelex => hars dat ionen capteert, zodat er minder ionen in oplossing zitten
=> door osmotische kracht zal cel water opnemen
=> concentratie ionen daalt, concentratie ionen buiten stijgt = gelijk
=> cel barst door osmotische druk (= zachte lyse en harde lyse)
Zachte lyse: 56°C zodat osmose werk kan doen
Harde lyse: bij kooktemp, zodat alle cellen barsten en
DNA vrij + denaturatie van afbraakeiwitten
=> bescherming DNA tegen DNasen (= breken DNA af)
- centrifugeren van DNA => DNA zit opgelost in supernatans
=> het pellet bestaat uit Chelex; mag niet in PCR reactie!
DNA-amplificatie met PCR: - in vitro techniek die DNA repliceert
- gebruikt Taq polymerase enzym (= bindt enkel op dubbelstrengig DNA)
- Taq = Thermus aquaticus (= van organisme dat in warmwater bronnen
leeft en kooktemperaturen overleeft!
Dit polymerase zal niet denatureren tijdens
temperatuursverhoging van PCR)
- gebruik ENKELSTRENGIG DNA als template voor synthese
- PRIMER nodig om PCR reactie te starten (= dubbelstrengig)
- verschillende cycli: denaturatie, annealing en elongatie
PCR: 1) Denaturatie = van dubbelstrengig DNA, twee enkelstrengige DNA ketens maken
=> verhit kort tot 95°C om alle H-bruggen te verbreken
2) Annealing = aanhechten van primer aan het template DNA (= enkelstrengig)
=> verlaag temperatuur!! Hoeveel verlagen hangt af van Tm (= smelttemperatuur)
