Samenvatting Genetics (GEN)

Samenvatting GEN Jaar 3
Hoorcollege 1 : CRISPR-CAS

Genomen bevatten genen : worden omgezet in eiwitten.
Eiwitten voeren functies uit
 Moment van expressie en hoeveelheid eiwit maakt ook uit
- Andere elementen bepalen de expressie van een gen: Promoter, enhancers, silencers

Hoe ga je onderzoek doen naar de functie van een gen of DNA element?
- Kloneren
- DNA (sequenties, motieven, homologieën)
- Eiwit (domeinen, homologieeën, 3D structuur)
Mutaties/deleties maken !
 willekeurige mutaties (drosophila) = toedienen carcinogene stof.
 Knock-out (KO) muizen
 Knock-in (KI) muizen
 Dubbel/tripel KO muizen = meerdere genen weghalen
Crispr-Cas ( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats):
Kan breuken in dsDNA specifiek maken.
- Bacterieel afweer systeem tegen virussen om gerichte
mutaties te maken.
Wanneer je gaat werken met CRISPR/CAS is het volgende nodig:
- CAS-9 eiwit, maakt de uiteindelijke knipjes
- tracrRNA, legt link tussen CAS-9 en crRNA
- crRNA, herkend specifieke side in het genoom

Na het CRISPR locus zijn er steeds repeats van de CAS genen. Dit heeft een grote invloed op het
immuunsysteem, wanneer een nieuw virus een bacterie infecteert pakken de CAS genen het DNA
van het virus. Deze bouwen ze in, in het CRISPR locus, zodat herkenning op kan treden en
uitschakeling in het vervolg versneld wordt.

 CAS operon (Crispr Associated Genes)= voor alle processen nodig
Verschillende CAS genen: CAS 9 knipt DNA in kleine stukjes. Aan beide kanten van het DNA ontstaat
een breuk waardoor er een dubbelstrengs breuk ontstaat.
 SgRNA (single guide RNA) = samenvoeging van crRNA en tracrRNA (PAM geen onderdeel van
sgRNA)
crRNA heeft een sequentie dat homoloog is aan het virale DNA.
 TracrRNA = homologe sequentie waardoor bindt
aan crRNA.
Dit wordt herkent door het CAS9 eiwit, doordat een RNA
structuur wordt gevormd door het tracrRNA waar CAS9 aan
bindt. CAS9 bindt aan een specifieke plek in het
virusgenoom waar de PAM side flankeert.
- Zonder PAM wordt CAS9 niet gebonden.

CAS9 bestaat uit twee endonuclease domeinen
 Protospacer ook in bacterieel genoom.
 PAM ( Protospacer Adjacent Motive) : een DNA sequentie van 2-6 basenparen (NGG)
onmiddellijk volgend op de DNA-sequentie waarop de CAS9 nuclease zich richt in het CRISPR
bacteriële adaptieve immuunsysteem.

,CAS-9 eiwit kan uit een bacterie gehaald worden en tot expressie gebracht worden in een plasmide.
(U6 promotor zorgt voor genexpressie).
Wanneer het complex met het eiwit bindt gaan de domeinen ongeveer 3 nt van de PAM side af
knippen, waardoor het virale DNA onwerkzaam wordt gemaakt.
> Er kunnen verschillende PAM sites zijn, die CAS9 herkent.
RuvC en HHH zijn de domeinen in CAS9 die beide het DNA enkelstrengs knippen
Uiteindelijk ontstaat er daardoor een dubbelstrengs breuk.

 Wat doet een cel met een DS-breuk?
Maken met behulp van homologe recombinatie (HR) of non-homologous
end-joining repair (NHEJ).
- HR: kan een insertie of mutatie maken, kan een specifieke knip
maken zodat een nieuw stuk erin gezet kan worden. Dit geeft de
mogelijkheid om het DNA te veranderen: genome editing.
- NHEJ: deletie van deel van het DNA.
Kan worden gebruikt om:
Een knock-out te maken van een bepaald gen, voor het bepalen van de functie van een gen.
 Richten tegen meerdere delen van gen.
 Richten tegen meerdere genen
- Belangrijk voor bepaalde functie ( celdeling, differiatie)
- Bepaalde cellulaire pathways (metabolisme, receptoren)

Andere toepassingen CRISPR CAS:
- Genregulatie: CAS eiwit kan aangepast worden zodat bepaalde genen worden afgezet.
- Cargo delivery: bepaalde delen methyleren of fluoresceren, histonen aanpassen enz.
- RNA cleavage: RNA aanvallen

Nadelen CRISPR CAS: “off targets effects”
- Knippen van DNA waartegen de sgRNA niet tegen gericht is.
Kan in honderden onvoorziene mutaties lopen.
Tegengaan ‘off target effects’: High Fidelity Enzymes
– SpCas9-HF1
– HypaCas9
– evoCas9
– Sniper-Cas
Nickases : een knipdomein weggehaald van CAS9
- Twee enkelstrengs breuken
- Kunnen weer samenvoegen
- Twee sites redelijk dicht bij elkaar nodig.

 SEED sequentie: zit in sgRNA
8-10 bp vanaf de PAM site
Begint de annealing
- Mismatches geen knip
- Non-seed mismatches, wel knip



Hoorcollege 2: CRISPR Cas & prokaryoten
Antibiotica resistentie is iets van de afgelopen duizenden jaren.

,  Bacteriofaag therapie is een mogelijke nieuwe oplossing, hierdoor kunnen verschillende
bacteriën worden uitgeschakeld.
‘lytische’ faag tegen specifieke bacterie -> maakt bacteriën kapot door middel van opblazen.
Veelbelovend, maar… :
- Mogelijk ‘collateral damage’op microbioom = leidt tot gezondheidsrisico’s, doordat het ook
essentiële bacteriën aanvalt.
- Niet patenteerbaar, waardoor de
farmaceutische industrie niet verder gaat met
ontwikkelen.
 Oplossing :
Combinatie CRISPR-Cas systeem met bacteriofagen:
schakel specifiek de pathogenen/ resistente variant uit
door op specifieke genen te ‘mikken’.

TracrRNA nodig voor Cas9 binding aan crRNA.
crRNA met specifieke target sequentie leidt Cas9 naar
knipplek.

M.b.v. de combinatie van CRISPR en fagen is een onderzoek
gedaan. M.b.v. CRISPR werden S. aureus
cellen met een chromosomaal kanamycine-resistentie gen
uitgeschakeld, deze bacteriën werden
geknipt op de plek van het gen.
Dit werd in vivo gebracht met behulp van muizen. De CRISPR
werd verpakt in een bacteriofaag, geen
lytische maar lysogene faag. Een lysogene faag blijft in leven na
het inspuiten van zijn genetische materiaal, zodat de bacterie
aanwezig blijft en onderzocht kan worden.
Zowel resistente als niet-resistente S. aureus werden aangebracht zodat de huidflora in tact bleef.
In de faag is het CRISPR-cas gekloneerd, de resistente variant werd met een GFP op de muis
aangebracht, de niet resistente variant werd zonder GFP aangebracht. Hierna is de CRISPR
toegevoegd in de lysogene faag. Als controle werd een groep behandeld zonder CRISPR, waardoor
veel GFP te zien was (dus veel resistente bacteriën aanwezig bleven).

Genome editing in bacteriën met CRISPR-Cas
 Gene editing of gene silencing bij eukaryoten
 Bacteriën gelijk dood.
Combineren met recombineering :
1) Recombineering (homologe recombinatie) = oligo met verandering toevoegen door middel
van omfloepen waardoor dit is veranderd in de nieuwe sequentie. -> Alle bacteriën zonder
nieuw stuk gaan dood, doordat de sequentie wordt herkend.
2) CRISPR-Cas
Voeg nu een CRISPR crRNA toe dat tegen het oorspronkelijke stukje DNA gericht is.
 PAM site is nodig voor het knippen van Cas9.

Je gaat een stuk van een gen veranderen zodat dit een
extra stopcodon bevat zodat translatie vroegtijdig wordt
gestopt.
Waar begin je mee?
Zoek op of er een (in frame) PAM site is (NGG), verderop
in de procedure heb je die namelijk nodig voor de
selectie met CRISPR-Cas

, Wat doe je daarna?
- Voeg een homologe oligo toe die aan weerszijde van de PAM site valt;
- De oligo bevat een stopcodon op de PAM-site. Stop = 5’TAA
- De eerste twee nucleotiden aan de 5’ kant van de 5’TAA zijn ook anders dan de oorspronkelijke
sequentie; dit is handig voor verderop in de procedure
Wat voeg je vervolgens toe?
De enzymen exo, beta en gam zodat homologe recombinatie kan plaatsvinden.
Nu heb je een mengsel van bacteriën waarin de recombinatie gelukt is en bacteriën waarin
recombinatie niet heeft plaatsgevonden.
Wat is nu de volgende stap?
- Voeg Cas9 en een CRISPR tegen de oorspronkelijke sequentie toe
- Nu wordt de onveranderde sequentie geknipt -> bacterie sterft
- De veranderde sequentie heeft geen PAM-site en heeft ook een mismatch van 2 nucleotiden met de
sgRNA -> die wordt dus niet geknipt -> bacterie leeft

Werkcollege 1: CRISPR-Cas
Voordelen zebravissen:
- Makkelijk te houden in grote getalen.
- Doorzichtig.
- 84% van de ziektegenen in het humane genoom zijn gelijk aan de ziektegenen van het
zebravis genoom.
Het atf3 gen kan genen die bij de immuunrespons betrokken zijn onderdrukken, omdat het een
transcriptional repressor is voor deze genen. Door dit gen uit te zetten zou het lichaam misschien
beter in staat zijn om een tuberculose infectie te bestrijden.

Het nadeel van het gebruik van morpholino’s is dat ze veel off-target effecten kunnen veroorzaken.
Dat betekent dat het effect op het fenotype dat na toediening van een morpholino wordt
waargenomen ook door aspecifieke downregulatie van een ander mRNA kan worden veroorzaakt. Dit
is de reden dat men vaak op een tweede manier probeert het mRNA / gen van interesse uit te
schakelen. In het geval van het atf3 gen is het plan om in de zebravis met behulp van CRISPR-Cas het
gen op DNA niveau te wijzigen zodat het niet meer codeert voor een functioneel mRNA.

De volgende CRISPR-Cas strategie zal worden gebruikt in zebravissen:
1) ontwerp het sgRNA tegen een specifieke plek van het atf3 gen
Het sgRNA bestaat uit een aantal onderdelen: de RNA
loops, tracrRNA en het crRNA.
Grofweg gezegd bestaat het sgRNA dus uit twee delen:
een algemeen deel (deel van het crRNA, RNA loop en
tracrRNA) waarvan de sequentie altijd hetzelfde is en een
specifiek deel (target-specifiek crRNA van 20 nucleotiden,
ook wel protospacer genoemd) waarvan de sequentie
gelijk moet zijn aan het targetgen.

2) synthetiseer het sgRNA door middel van PCR en
in vitro transcriptie (IVT)
Het sgRNA kan gemaakt worden door eerst een PCR uit te
voeren en daarna een in vitro transcriptie vanaf een T7-
promoter te doen. Schematisch ziet dat er zo uit: