Les 8
IPSC als onderzoeksmethode in het domein van
cardiologie – IPSC in Cardiogenetics Research
1. iPSC recap
Induced pluripotente stamcellen (iPSCs) doen ons denken aan de cellen die aanwezig zijn in een
embryo, omdat ze het unieke vermogen hebben om te di@erentiëren naar elk willekeurig celtype
in het lichaam. Een van hun opmerkelijke eigenschappen is dat ze zich onbeperkt kunnen blijven
delen, wat hen ideaal maakt voor onderzoek en therapieën. Het verschil met embryonale
stamcellen is echter dat iPSCs worden afgeleid van volwassen, volledig gedi@erentieerde cellen,
zoals huidcellen. Dit proces, bekend als 'inductie', wordt gecontroleerd door de onderzoeker. Door
specifieke factoren toe te voegen, kunnen volwassen cellen worden gereprogrammeerd naar een
pluripotente staat.
In het geval van patiënten wordt er vaak een biopsie genomen, waarna de verkregen cellen worden
blootgesteld aan zogenaamde reprogrammatiefactoren die de inductie van pluripotentie mogelijk
maken. De bekendste factoren die hierbij worden gebruikt, zijn de Yamanaka-factoren (Oct4
(Pou5f1), Sox2, Klf4 and cMyc) . Dit zijn transcriptiefactoren die ervoor zorgen dat de volwassen
cel zijn di@erentiatieproces terugdraait en zich opnieuw gaat gedragen als een stamcel.
iPSCs hebben enkele typische kenmerken, waaronder een relatief grote kern in verhouding tot hun
cytoplasma, en ze zijn meestal klein en rond van vorm. Een veelgebruikte procedure is het
herprogrammeren van fibroblasten naar iPSCs. Tijdens dit proces ondergaan de cellen een
opvallende verandering in vorm en functie, waarbij ze worden teruggedi@erentieerd naar een
celtype dat de onderzoeker wil bestuderen. Dit kan bijvoorbeeld worden toegepast in
drugscreening of om te onderzoeken welke verschillen er zijn tussen zieke en gezonde cellen.
2. iPSC generation
Het proces van het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) begint met
somatische cellen, zoals huidfibroblasten of bloedcellen, die van nature niet meer kunnen
1
, delen. Bij bloedcellen wordt een bloedstaal gecentrifugeerd, waarbij de witte bloedcellen
(WBC) in het midden worden verzameld. Uit deze laag kunnen monocyten worden gehaald,
wat vaak de voorkeur heeft boven het gebruik van huidfibroblasten. Daarnaast kunnen ook
cellen uit urine worden gebruikt.
Deze somatische cellen worden in cultuur gebracht in het laboratorium. Om ze te
herprogrammeren naar iPSCs, worden vier transcriptiefactoren ingebracht. Deze vier
transcriptiefactoren worden meestal in afzonderlijke tubes geprepareerd en vervolgens in een
vector, zoals het Sendai-virus, gebruikt om de transcriptiefactoren in de cel te introduceren. Dit
virus dient als drager om de reprogrammeringsfactoren in de cellen te brengen. Het hele
proces duurt ongeveer drie maanden.
Het protocol begint op dag 0 met de transductie van de cellen met het Sendai-virus en de
transcriptiefactoren. Na ongeveer een week worden de cellen uitgeplateerd. Op dit moment
verandert het kweekmedium van fibroblastmedium naar iPSC-medium om de groei van
stamcellen te bevorderen. Terwijl de kolonies groeien, zijn ze te herkennen aan hun afgeronde
vorm, waarbij de kleine cellen dicht op elkaar zitten. De gevormde kolonies worden vervolgens
zorgvuldig overgeplaatst met een pipet naar een nieuw plaatje voor verdere groei.
Validatie van de gegenereerde iPSCs is essentieel. Hierbij worden specifieke merkers
geanalyseerd die kenmerkend zijn voor stamcellen, bijvoorbeeld door middel van
immunostaining of qPCR. Bovendien wordt getest of deze stamcellen in staat zijn te
differentiëren naar de verschillende kiemlagen, net zoals in het embryonale stadium, waar
ectoderm, mesoderm en endoderm worden gevormd. Door de iPSCs in een cultuur te plaatsen
waar ze zich niet kunnen aanhechten, vormen ze zogenaamde embryonic bodies, groepjes
cellen die spontaan beginnen te differentiëren. Via RNA-extractie en qPCR kan dan worden
aangetoond dat de cellen expressie vertonen van specifieke merkers voor elk van de drie
kiemlagen.
3. Differentiation to cardiomyocytes
Vanuit deze iPSCs worden cardiomyocyten (CMs) afgeleid, die afkomstig zijn van het
mesoderm. De eerste stap is dus om de iPSCs te differentiëren naar het mesodermstadium,
vervolgens naar cardiale progenitorcellen, en uiteindelijk naar volwassen cardiomyocyten.
Een van de vroege methoden om dit te bereiken was het gebruik van embryonic body-formatie,
waarbij de cellen groeien in clusters. Aan deze clusters werden specifieke groeifactoren
toegevoegd om differentiatie te sturen. Echter, deze methode bleek omslachtig, omdat veel
cellen ontstaan die niet nodig zijn voor de productie van cardiomyocyten.
Meer recent worden monolaagprotocollen toegepast, waarbij de cellen in een enkele laag
worden gekweekt en behandeld met groeifactoren of kleine chemische moleculen (small
molecules) die bekend zijn om hun effect op specifieke signaalroutes. Eén veelgebruikte
molecuul is CHIR99021, een GSK3-remmer die de Wnt-signaleringsroute activeert. Dit
activeert de overgang van iPSCs naar het mesodermstadium. Na twee dagen wordt de Wnt-
route weer geremd om verdere differentiatie naar cardiale progenitorcellen en uiteindelijk naar
2
IPSC als onderzoeksmethode in het domein van
cardiologie – IPSC in Cardiogenetics Research
1. iPSC recap
Induced pluripotente stamcellen (iPSCs) doen ons denken aan de cellen die aanwezig zijn in een
embryo, omdat ze het unieke vermogen hebben om te di@erentiëren naar elk willekeurig celtype
in het lichaam. Een van hun opmerkelijke eigenschappen is dat ze zich onbeperkt kunnen blijven
delen, wat hen ideaal maakt voor onderzoek en therapieën. Het verschil met embryonale
stamcellen is echter dat iPSCs worden afgeleid van volwassen, volledig gedi@erentieerde cellen,
zoals huidcellen. Dit proces, bekend als 'inductie', wordt gecontroleerd door de onderzoeker. Door
specifieke factoren toe te voegen, kunnen volwassen cellen worden gereprogrammeerd naar een
pluripotente staat.
In het geval van patiënten wordt er vaak een biopsie genomen, waarna de verkregen cellen worden
blootgesteld aan zogenaamde reprogrammatiefactoren die de inductie van pluripotentie mogelijk
maken. De bekendste factoren die hierbij worden gebruikt, zijn de Yamanaka-factoren (Oct4
(Pou5f1), Sox2, Klf4 and cMyc) . Dit zijn transcriptiefactoren die ervoor zorgen dat de volwassen
cel zijn di@erentiatieproces terugdraait en zich opnieuw gaat gedragen als een stamcel.
iPSCs hebben enkele typische kenmerken, waaronder een relatief grote kern in verhouding tot hun
cytoplasma, en ze zijn meestal klein en rond van vorm. Een veelgebruikte procedure is het
herprogrammeren van fibroblasten naar iPSCs. Tijdens dit proces ondergaan de cellen een
opvallende verandering in vorm en functie, waarbij ze worden teruggedi@erentieerd naar een
celtype dat de onderzoeker wil bestuderen. Dit kan bijvoorbeeld worden toegepast in
drugscreening of om te onderzoeken welke verschillen er zijn tussen zieke en gezonde cellen.
2. iPSC generation
Het proces van het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) begint met
somatische cellen, zoals huidfibroblasten of bloedcellen, die van nature niet meer kunnen
1
, delen. Bij bloedcellen wordt een bloedstaal gecentrifugeerd, waarbij de witte bloedcellen
(WBC) in het midden worden verzameld. Uit deze laag kunnen monocyten worden gehaald,
wat vaak de voorkeur heeft boven het gebruik van huidfibroblasten. Daarnaast kunnen ook
cellen uit urine worden gebruikt.
Deze somatische cellen worden in cultuur gebracht in het laboratorium. Om ze te
herprogrammeren naar iPSCs, worden vier transcriptiefactoren ingebracht. Deze vier
transcriptiefactoren worden meestal in afzonderlijke tubes geprepareerd en vervolgens in een
vector, zoals het Sendai-virus, gebruikt om de transcriptiefactoren in de cel te introduceren. Dit
virus dient als drager om de reprogrammeringsfactoren in de cellen te brengen. Het hele
proces duurt ongeveer drie maanden.
Het protocol begint op dag 0 met de transductie van de cellen met het Sendai-virus en de
transcriptiefactoren. Na ongeveer een week worden de cellen uitgeplateerd. Op dit moment
verandert het kweekmedium van fibroblastmedium naar iPSC-medium om de groei van
stamcellen te bevorderen. Terwijl de kolonies groeien, zijn ze te herkennen aan hun afgeronde
vorm, waarbij de kleine cellen dicht op elkaar zitten. De gevormde kolonies worden vervolgens
zorgvuldig overgeplaatst met een pipet naar een nieuw plaatje voor verdere groei.
Validatie van de gegenereerde iPSCs is essentieel. Hierbij worden specifieke merkers
geanalyseerd die kenmerkend zijn voor stamcellen, bijvoorbeeld door middel van
immunostaining of qPCR. Bovendien wordt getest of deze stamcellen in staat zijn te
differentiëren naar de verschillende kiemlagen, net zoals in het embryonale stadium, waar
ectoderm, mesoderm en endoderm worden gevormd. Door de iPSCs in een cultuur te plaatsen
waar ze zich niet kunnen aanhechten, vormen ze zogenaamde embryonic bodies, groepjes
cellen die spontaan beginnen te differentiëren. Via RNA-extractie en qPCR kan dan worden
aangetoond dat de cellen expressie vertonen van specifieke merkers voor elk van de drie
kiemlagen.
3. Differentiation to cardiomyocytes
Vanuit deze iPSCs worden cardiomyocyten (CMs) afgeleid, die afkomstig zijn van het
mesoderm. De eerste stap is dus om de iPSCs te differentiëren naar het mesodermstadium,
vervolgens naar cardiale progenitorcellen, en uiteindelijk naar volwassen cardiomyocyten.
Een van de vroege methoden om dit te bereiken was het gebruik van embryonic body-formatie,
waarbij de cellen groeien in clusters. Aan deze clusters werden specifieke groeifactoren
toegevoegd om differentiatie te sturen. Echter, deze methode bleek omslachtig, omdat veel
cellen ontstaan die niet nodig zijn voor de productie van cardiomyocyten.
Meer recent worden monolaagprotocollen toegepast, waarbij de cellen in een enkele laag
worden gekweekt en behandeld met groeifactoren of kleine chemische moleculen (small
molecules) die bekend zijn om hun effect op specifieke signaalroutes. Eén veelgebruikte
molecuul is CHIR99021, een GSK3-remmer die de Wnt-signaleringsroute activeert. Dit
activeert de overgang van iPSCs naar het mesodermstadium. Na twee dagen wordt de Wnt-
route weer geremd om verdere differentiatie naar cardiale progenitorcellen en uiteindelijk naar
2
