Medische biochemie deel hematologie
Hoofdstuk 1: diagnostiek binnen de hematologie
Basiskennis werking automatische celtellers
Impedantie
• Complete blood count (CBC)
o Rode bloedcellen, witte bloedcellen,
hemoglobine, bloedplaatjes,…
• Impedantie of elektrische weerstand
o Als een cel door de telopening
passeert veranderd de elektrische
weestand en de weerstand van de
radiofrequentie tussen de elektrodes
o Pulshoogte reflecteert het volume
van die cel dat door het apparatuur
gaat
▪ Hematocriet = RBC puls hoogte
o Baseert zich enkel op grootte
▪ Mate van impedantie meting is recht evenredig met het volume van de
cel
o Meerdere deeltjes met dezelfde grootte = interferentie
o Noodzaak van een 2de techniek (optisch of fluorescentie)
1
,Fluorescentiemeting
• Fluorescentie meting
o Cel met laser licht bestralen + laser licht opvangen in voorwaartse richting (=
grootte van cellen) + zijwaartse richting (= korreling in cel + kernstructuur in de
cel)
o Fluorescente stoffen + reactie DNA en RNA → rode bloedcel = geen DNA →
witte wel nog
o Rode bloedcellen = geen fluorescentie = geen DNA en RNA
o Veel RNA = veel fluorescentie → net uit beenmerg komen
o Weinig RNA = meer naar rode bloedcel toe = minder fluorescentie
o Bloed uitstrijkje = microscopisch bekijken → digitaal
o 50-100 µl → 100 tal witte bloedcellen uitnemen = aselectieve steekproef →
relevant maar lage gevoeligheid
▪ 1 a 2% pathologie = soms niet detecteerbaar = gevoeligere methode
nodig
• Geen onderscheid tussen B en T lymfocyten bij microscopie
Natriumlaurylsulfaat (SLS) hemoglobine meting
• Na lysis van rode bloed cel zal hemoglobine binden aan natriumlaurylsulfaat (SLS)
o Conformatie verandering van hemoglobine
o Aanleiding tot oxidatie van Fe2+ naar Fe3+
o Fe3+ bindt aan hydrofiele groep van SLS
• Concentratie SLS-methemoglobine kan worden gemeten met specrofotometer bij
532nm
• Optische meting = vroeger met cyanide
2
,Basisprincipe flowcelcytometrie
Flowcytometrie met semi-conductor laser
• Witte bloedcellen geteld en gedifferentieerd
• 2 kanalen gebruikt
o 4DIFF kanaal
▪ Kunnen onderscheiden
• Lymfocyten, monocyten, eosinofielen, neutrofielen en basofielen
o WBC/BASO kanaal
▪ Totaal aantal witte bloedcellen bepaald en aantal basofielen
• Semi-conductor laserstraal gericht op de cellen
o Voorwaartse scatter (FSC)
▪ Informatie over de celgrootte
▪ Opgevangen door fotodiodes
▪ Licht omgezet in elektrische signalen
o Zijdelingse scatter (SSC)
▪ Informatie over de cel inhoud
▪ Intensiteit van licht hangt af van de nucleïnezuur inhoud van de cel
▪ Opgevangen door fotomultiplier tube
▪ Licht omgezet in elektrische signalen
Immuunfenotypering
• Elk stadia brengt typische antigenen tot expressie
o Cluster of differentiation (CD)
o Met flowcytometrie opgespoord
• CD 19 = B lymfocyten
• CD 3 = T lymfocyten
• CD 45 = op alle witte bloedcellen
• CD 34 = op jonge cellen (stamcellen, etc.) → bij
donoren + groeifactoren of er genoeg cellen
aanwezig zijn
3
, Hydrodynamische focussing
• Juiste oriëntatie van de cel tegenover meetapparaat
• Sheath flow = vloeistofstroom
o Buffer die de cellen omringt
o 1/500 verdunnen van staal om het dan door de impedantie
meter te sturen
▪ Cellen gaan zo omringd door sheath vloeistof vanuit conische kamer 1 voor
1 door de opening
o Sheath vloeistof
▪ Snelheid in het midden is groter dan aan de rand, daardoor gaan cellen één
voor één door electrode
▪ Heeft een hogere snelheid → vloeistofstroom wordt gefocust
• Cellen gaan individueel in de flowkamer
• 20 000 cellen/s door 1 of meerdere lasers aangestraald
• Microscopisch onderscheid niet zien tussen T en B lymfocyten
o T = CD 3 → antistof koppelen + fluorescente kleurstof
o B = CD 19 → antistof koppelen + fluorescente kleurstof
o Exciteert door laserlicht + gaat licht uitzenden
o Verschil in maximale energie bij emissie en excitatie van fluorochromen
Differentiatie cellen
• Forward- en side scatter
o Foward scatter komt overeen met de grootte van de cel
o Side scatter komt overeen met de interne structuur en granulatie
• Overlap
o Geïmiteerd licht gaat door filters = deel van de overlap wordt opgevangen maar
ander deel niet → compensatie
4
Hoofdstuk 1: diagnostiek binnen de hematologie
Basiskennis werking automatische celtellers
Impedantie
• Complete blood count (CBC)
o Rode bloedcellen, witte bloedcellen,
hemoglobine, bloedplaatjes,…
• Impedantie of elektrische weerstand
o Als een cel door de telopening
passeert veranderd de elektrische
weestand en de weerstand van de
radiofrequentie tussen de elektrodes
o Pulshoogte reflecteert het volume
van die cel dat door het apparatuur
gaat
▪ Hematocriet = RBC puls hoogte
o Baseert zich enkel op grootte
▪ Mate van impedantie meting is recht evenredig met het volume van de
cel
o Meerdere deeltjes met dezelfde grootte = interferentie
o Noodzaak van een 2de techniek (optisch of fluorescentie)
1
,Fluorescentiemeting
• Fluorescentie meting
o Cel met laser licht bestralen + laser licht opvangen in voorwaartse richting (=
grootte van cellen) + zijwaartse richting (= korreling in cel + kernstructuur in de
cel)
o Fluorescente stoffen + reactie DNA en RNA → rode bloedcel = geen DNA →
witte wel nog
o Rode bloedcellen = geen fluorescentie = geen DNA en RNA
o Veel RNA = veel fluorescentie → net uit beenmerg komen
o Weinig RNA = meer naar rode bloedcel toe = minder fluorescentie
o Bloed uitstrijkje = microscopisch bekijken → digitaal
o 50-100 µl → 100 tal witte bloedcellen uitnemen = aselectieve steekproef →
relevant maar lage gevoeligheid
▪ 1 a 2% pathologie = soms niet detecteerbaar = gevoeligere methode
nodig
• Geen onderscheid tussen B en T lymfocyten bij microscopie
Natriumlaurylsulfaat (SLS) hemoglobine meting
• Na lysis van rode bloed cel zal hemoglobine binden aan natriumlaurylsulfaat (SLS)
o Conformatie verandering van hemoglobine
o Aanleiding tot oxidatie van Fe2+ naar Fe3+
o Fe3+ bindt aan hydrofiele groep van SLS
• Concentratie SLS-methemoglobine kan worden gemeten met specrofotometer bij
532nm
• Optische meting = vroeger met cyanide
2
,Basisprincipe flowcelcytometrie
Flowcytometrie met semi-conductor laser
• Witte bloedcellen geteld en gedifferentieerd
• 2 kanalen gebruikt
o 4DIFF kanaal
▪ Kunnen onderscheiden
• Lymfocyten, monocyten, eosinofielen, neutrofielen en basofielen
o WBC/BASO kanaal
▪ Totaal aantal witte bloedcellen bepaald en aantal basofielen
• Semi-conductor laserstraal gericht op de cellen
o Voorwaartse scatter (FSC)
▪ Informatie over de celgrootte
▪ Opgevangen door fotodiodes
▪ Licht omgezet in elektrische signalen
o Zijdelingse scatter (SSC)
▪ Informatie over de cel inhoud
▪ Intensiteit van licht hangt af van de nucleïnezuur inhoud van de cel
▪ Opgevangen door fotomultiplier tube
▪ Licht omgezet in elektrische signalen
Immuunfenotypering
• Elk stadia brengt typische antigenen tot expressie
o Cluster of differentiation (CD)
o Met flowcytometrie opgespoord
• CD 19 = B lymfocyten
• CD 3 = T lymfocyten
• CD 45 = op alle witte bloedcellen
• CD 34 = op jonge cellen (stamcellen, etc.) → bij
donoren + groeifactoren of er genoeg cellen
aanwezig zijn
3
, Hydrodynamische focussing
• Juiste oriëntatie van de cel tegenover meetapparaat
• Sheath flow = vloeistofstroom
o Buffer die de cellen omringt
o 1/500 verdunnen van staal om het dan door de impedantie
meter te sturen
▪ Cellen gaan zo omringd door sheath vloeistof vanuit conische kamer 1 voor
1 door de opening
o Sheath vloeistof
▪ Snelheid in het midden is groter dan aan de rand, daardoor gaan cellen één
voor één door electrode
▪ Heeft een hogere snelheid → vloeistofstroom wordt gefocust
• Cellen gaan individueel in de flowkamer
• 20 000 cellen/s door 1 of meerdere lasers aangestraald
• Microscopisch onderscheid niet zien tussen T en B lymfocyten
o T = CD 3 → antistof koppelen + fluorescente kleurstof
o B = CD 19 → antistof koppelen + fluorescente kleurstof
o Exciteert door laserlicht + gaat licht uitzenden
o Verschil in maximale energie bij emissie en excitatie van fluorochromen
Differentiatie cellen
• Forward- en side scatter
o Foward scatter komt overeen met de grootte van de cel
o Side scatter komt overeen met de interne structuur en granulatie
• Overlap
o Geïmiteerd licht gaat door filters = deel van de overlap wordt opgevangen maar
ander deel niet → compensatie
4
