TEMA 5- TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
1. TÉCINAS DE HIBRIDACIÓN SEGÚN EL MEDIO
1.1 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO
Def: se caracterizan porque una de las dos moléculas implicadas, la secuencia diana o la
sonda se inmovilizan sobre un soporte sólido previo a la hibridación.
Lo habitual es fijar el soporte la muestra que contiene la secuencia diana e incubar
posteriormente con la sonda marcada para formar el híbrido. En esta metodología se
basan las técnicas de Dot blot, Southern nlot y Northern blot.
En otras ocasiones se obtienen más información fijando al soporte la sonda e incubando
posteriormente con el ácido nucleico que se estudia, previamente marcado. En esta
metodología se basan por ejemplo los Microarrays
1.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
Def: el híbrido sonda/ secuencia diana se forma en solución normalmente en pocillos de
una placa microtiter y posteriormente se fija a la pared del pocillo para proceder a su
detección.
• Habitualmente no se marca ni la sonda ni la muestra
• El híbrido se detecta por métodos indirectos más o menos complejos
Estas técnicas se han desarrollado fundamentalmente para diagnóstico microbiológico y
especialmente para la detección de virus
Su realización es similar a la de los inmunoensayos tipo ELISA, permiten analizar múltiples
muestras simultáneamente y son fácilmente autoanalizables. Las más importantes son la
técnica de captura de híbrido y la técnica de ADN ramificado
1.3 técnicas de hibridación in situ
Def: son las técnicas en las que la hibridación de los ácidos nucleicos se realiza
directamente sobre las extensiones citológicas o secreciones de tejido y el resultado
obtenido se analiza microscópicamente
2. DOT BLOT
Def: es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon
como soporte sólido y que permite detectar secuencias de ácidos nucleicos, ADN, ARN,
en una mezcla compleja, sin aportar ninguna información adicional
Es la forma más simple de hibridación. Sobre las membranas de nitrocelulosa o de nailon,
se coloca directamente una gota de la muestra que se va a analizar, que puede ser un
ácido nucleico purificado, un lisado celular, un producto de amplificación por PCR etc.
,Esta técnica permite el estudio simultáneo de varias muestras, aplicando cada muestra en
una zona distinta de la membrana y se puede realizar con sondas radiactivas o con
sondas marcadas por haptenos. Son las aplicaciones se realizan en forma de banda en
lugar de forma circular, la técnica se denomina Slot blot.
La técnica se lleva a cabo incubando secuencialmente las membranas con los reactivos
por inmersión de las cubetas, en bolsas de plástico termosellables o con cierre hermético o
en frascos de tapón de rosca.
2.1 PROTOCOLO DEL DOT BLOT
I. APLICACIÓN DE LA MUESTRA AL SOPORTE
1. Humedecer la membrana que actúa de soporte sólido mediante inmersión durante
10 min en y tampón adecuado o agua destilada
2. Se saca del líquido humectante y se retira el exceso de este colocando la
membrana entre dos hojas de papel de filtro
3. Una vez humedecida la membrana, se ensambla un sistema de vacío que es el que
va a permitir que se consiga una adecuada fijación de la muestra a la membrana
4. El proceso de aplicación de la muestra varía para ADN y ARN
5. En cualquier caso, una vez iniciada la técnica la membrana no debe secarse en
ningún momento
Aplicación de muestras de ADN
1. Las muestras de ADN deben ser desnaturalizadas antes de su aplicación a la
membrana con Hidróxido sódico y EDTA a 100ºC
2. Se neutralizan
3. Se cargan en las posiciones correspondientes de la plantilla y se aplica vacío. El
ADN de la muestra queda retenido en la membrana, mientras que todos los
reactivos se filtran a la cámara colectora
4. Cada muestra puede ser lavada cargando el correspondiente pocillo hidróxido
sódico y filtrándolo al vacío
5. Se desmonta el sistema de vacío, se lava la membrana con SSC y se seca en estufa
a 80ºC durante 30-120min para unir permanentemente el ADN a la membrana. Las
muestras dispuestas sobre membranas de nailon pueden ser ancladas
definitivamente a estas mediante radiación con luz ultravioleta
Aplicación de muestras de ARN
1. Conviene desnaturalizar también las muestras de ARN con sosa de menor
concentración
2. El lavado se realiza con la misma solución
, II. PREHIBRIDACIÓN
1. Las membranas con las muestras se incuban con una solución de prehibridación
para bloquear las posibles uniones específicas de la sonda a la membrana, de
manera que al añadir ésta solo se pueda unir de manera específica a la secuencia
diana
2. La solución prehibridación suele tener la misma composición que las soluciones de
hibridación, pero sin sonda
3. La membrana se incuba con esta solución a la misma temperatura que se realizará
posteriormente la hibridación, normalmente a 65-68ºC
iii. HIBRIDACIÓN
1. Las sondas de ADN bicatenario se desnaturalizan inmediatamente antes de su uso,
mediante calentamiento a 95-100ºC durante 5 min y enfriamiento rápido con hielo
2. Para realizar la hibridación se retira la solución de prehibridación del contenedor en
el que se está realizando la técnica y se sustituye por un volumen igual de solución
fresca a la que se le añade la sonda recién desnaturalizada
3. La membrana se incuba con esta solución a la temperatura adecuada en
agitación durante 4-24h
IV.LAVADO POSTHIBRIDACIÓN
Si las dos fases anteriores se han llevado a cabo en bolsa se saca la membrana de la
bolsa y se coloca una cubeta para proceder a los lavados de posthibridacion en
agitación, entre 2-3 lavados
V.DETECCIÓN DEL HÍBRIDO
Marcado radiactivo: si la sonda empleada está marcada radiactivamente, finalizado el
último lavado de poshibridación la membrana se puede secar y revelar mediante
exposición autorradiografica, colocando una placa radiográfica encima y manteniendo
el conjunto en oscuridad durante horas-días
• Al revelar la placa aparecerán puntos negros en las posiciones correspondientes a
las muestras positivas, es decir, aquellas que contenían la secuencia diana
Marcado con haptenos: si la sonda empleada está marcada con haptenos a
continuación de los lavados se revela con un método de detección cromogénico. El
resultado final es una mancha coloreada en las posiciones correspondientes a las
muestras positivas
1. TÉCINAS DE HIBRIDACIÓN SEGÚN EL MEDIO
1.1 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO
Def: se caracterizan porque una de las dos moléculas implicadas, la secuencia diana o la
sonda se inmovilizan sobre un soporte sólido previo a la hibridación.
Lo habitual es fijar el soporte la muestra que contiene la secuencia diana e incubar
posteriormente con la sonda marcada para formar el híbrido. En esta metodología se
basan las técnicas de Dot blot, Southern nlot y Northern blot.
En otras ocasiones se obtienen más información fijando al soporte la sonda e incubando
posteriormente con el ácido nucleico que se estudia, previamente marcado. En esta
metodología se basan por ejemplo los Microarrays
1.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
Def: el híbrido sonda/ secuencia diana se forma en solución normalmente en pocillos de
una placa microtiter y posteriormente se fija a la pared del pocillo para proceder a su
detección.
• Habitualmente no se marca ni la sonda ni la muestra
• El híbrido se detecta por métodos indirectos más o menos complejos
Estas técnicas se han desarrollado fundamentalmente para diagnóstico microbiológico y
especialmente para la detección de virus
Su realización es similar a la de los inmunoensayos tipo ELISA, permiten analizar múltiples
muestras simultáneamente y son fácilmente autoanalizables. Las más importantes son la
técnica de captura de híbrido y la técnica de ADN ramificado
1.3 técnicas de hibridación in situ
Def: son las técnicas en las que la hibridación de los ácidos nucleicos se realiza
directamente sobre las extensiones citológicas o secreciones de tejido y el resultado
obtenido se analiza microscópicamente
2. DOT BLOT
Def: es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon
como soporte sólido y que permite detectar secuencias de ácidos nucleicos, ADN, ARN,
en una mezcla compleja, sin aportar ninguna información adicional
Es la forma más simple de hibridación. Sobre las membranas de nitrocelulosa o de nailon,
se coloca directamente una gota de la muestra que se va a analizar, que puede ser un
ácido nucleico purificado, un lisado celular, un producto de amplificación por PCR etc.
,Esta técnica permite el estudio simultáneo de varias muestras, aplicando cada muestra en
una zona distinta de la membrana y se puede realizar con sondas radiactivas o con
sondas marcadas por haptenos. Son las aplicaciones se realizan en forma de banda en
lugar de forma circular, la técnica se denomina Slot blot.
La técnica se lleva a cabo incubando secuencialmente las membranas con los reactivos
por inmersión de las cubetas, en bolsas de plástico termosellables o con cierre hermético o
en frascos de tapón de rosca.
2.1 PROTOCOLO DEL DOT BLOT
I. APLICACIÓN DE LA MUESTRA AL SOPORTE
1. Humedecer la membrana que actúa de soporte sólido mediante inmersión durante
10 min en y tampón adecuado o agua destilada
2. Se saca del líquido humectante y se retira el exceso de este colocando la
membrana entre dos hojas de papel de filtro
3. Una vez humedecida la membrana, se ensambla un sistema de vacío que es el que
va a permitir que se consiga una adecuada fijación de la muestra a la membrana
4. El proceso de aplicación de la muestra varía para ADN y ARN
5. En cualquier caso, una vez iniciada la técnica la membrana no debe secarse en
ningún momento
Aplicación de muestras de ADN
1. Las muestras de ADN deben ser desnaturalizadas antes de su aplicación a la
membrana con Hidróxido sódico y EDTA a 100ºC
2. Se neutralizan
3. Se cargan en las posiciones correspondientes de la plantilla y se aplica vacío. El
ADN de la muestra queda retenido en la membrana, mientras que todos los
reactivos se filtran a la cámara colectora
4. Cada muestra puede ser lavada cargando el correspondiente pocillo hidróxido
sódico y filtrándolo al vacío
5. Se desmonta el sistema de vacío, se lava la membrana con SSC y se seca en estufa
a 80ºC durante 30-120min para unir permanentemente el ADN a la membrana. Las
muestras dispuestas sobre membranas de nailon pueden ser ancladas
definitivamente a estas mediante radiación con luz ultravioleta
Aplicación de muestras de ARN
1. Conviene desnaturalizar también las muestras de ARN con sosa de menor
concentración
2. El lavado se realiza con la misma solución
, II. PREHIBRIDACIÓN
1. Las membranas con las muestras se incuban con una solución de prehibridación
para bloquear las posibles uniones específicas de la sonda a la membrana, de
manera que al añadir ésta solo se pueda unir de manera específica a la secuencia
diana
2. La solución prehibridación suele tener la misma composición que las soluciones de
hibridación, pero sin sonda
3. La membrana se incuba con esta solución a la misma temperatura que se realizará
posteriormente la hibridación, normalmente a 65-68ºC
iii. HIBRIDACIÓN
1. Las sondas de ADN bicatenario se desnaturalizan inmediatamente antes de su uso,
mediante calentamiento a 95-100ºC durante 5 min y enfriamiento rápido con hielo
2. Para realizar la hibridación se retira la solución de prehibridación del contenedor en
el que se está realizando la técnica y se sustituye por un volumen igual de solución
fresca a la que se le añade la sonda recién desnaturalizada
3. La membrana se incuba con esta solución a la temperatura adecuada en
agitación durante 4-24h
IV.LAVADO POSTHIBRIDACIÓN
Si las dos fases anteriores se han llevado a cabo en bolsa se saca la membrana de la
bolsa y se coloca una cubeta para proceder a los lavados de posthibridacion en
agitación, entre 2-3 lavados
V.DETECCIÓN DEL HÍBRIDO
Marcado radiactivo: si la sonda empleada está marcada radiactivamente, finalizado el
último lavado de poshibridación la membrana se puede secar y revelar mediante
exposición autorradiografica, colocando una placa radiográfica encima y manteniendo
el conjunto en oscuridad durante horas-días
• Al revelar la placa aparecerán puntos negros en las posiciones correspondientes a
las muestras positivas, es decir, aquellas que contenían la secuencia diana
Marcado con haptenos: si la sonda empleada está marcada con haptenos a
continuación de los lavados se revela con un método de detección cromogénico. El
resultado final es una mancha coloreada en las posiciones correspondientes a las
muestras positivas
