TEMA 3- EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
1. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN: LA PRIMERA ETAPA
Los ácidos nucleicos se encuentran confinados en el interior de las células, bien en el
núcleo, en el seno del citoplasma o en orgánulos celulares como mitocondrias y
cloroplastos
Membranas celulares: son las estructuras que limitan a la célula y además le permiten
tener relación con el medio exterior. Químicamente están constituidas por una bicapa
lipídica en cuyo seno se encuentra dispersa una gran variedad de proteínas
Pared celular: peculiaridad común a bacterias, levaduras, hongos y células vegetales es
una capa que recubre la membrana celular y proporciona rigidez y protección a las
células. Químicamente su composición es variable según el tipo de organismo que se trate
Las membranas y paredes constituyen una verdadera barrera que se deberá vencer si
queremos tener acceso a los ácidos nucleicos. Por esto su análisis y manipulación
mediante técnicas de biología molecular comporta en la mayor parte de los casos una
primera etapa de extracción y purificación
• Con la extracción conseguimos accesibles los ácidos nucleicos a los reactivos y
enzimas que se emplean en las diversas técnicas; la purificación eliminamos las
sustancias y elementos que pueden interferir en ellos
La obtención de los ácidos nucleicos purificados a partir de una muestra biológica se sele
llevar a cabo mediante un uno protocolo técnico continuado
1. Pretratamiento de la muestra
2. Extracción de los ácidos nucleicos
3. Purificación de los ácidos nucleicos
2. PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
Los ácidos nucleicos se pueden obtener prácticamente de cualquier muestra biológica.
Pero dada la gran diversidad y variabilidad del posible material de partida en muchas
ocasiones se requiere un pretratamiento específico de la muestra biológica que permite
obtener las suspensiones celulares sobre los que se realizara la extracción y purificación de
ácidos nucleicos
Suspensiones celulares: formada por células libres y agregados celulares que flotan en el
seno de un medio líquido
,2.1 SANGRE
La sangre es una de las muestras biológicas más habituales para estudiar los ácidos
nucleicos de un individuo purificándolos a partir de uno de sus componentes celulares, los
leucocitos. Muchos de los componentes sanguíneos interfieren en las técnicas de biología
molecular. El grupo hemo de la hemoglobina es un potente inhibidor de la PCR por lo que
un objetivo común en los distintos pretratamientos es la eliminación de la hemoglobina por
medio de la lisis de los hematíes
CONSIDERACIONES SOBRE LA OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA
Para la obtención de ácidos nucleicos en una muestra de sangre lo ideal es partir de
sangre total anticoagulada con EDTA, pero la heparina y el citrato sódico también se
pueden usar como anticoagulante
La extracción de ácidos nucleicos es conveniente realizarlas en las 24h siguientes a la
obtención de la muestra, pero en caso contrario se puede conservar en refrigeración a
4ºC durante 5 días. Sin embargo, si se van a aplicar técnicas que requieren moléculas
intactas de ADN sin fragmentar como el Shouthern blot la sangre no debería almacenarse
en nevera más de 3 días
LISIS DE LOS HEMATÍES
1.Lisis de los hematíes: consiste en romper los hematíes con una solución o tampón lisis,
actualmente hay muchas soluciones lisis comerciales la mayoría de ellas basadas en
fenómenos o en detergentes suaves
2. Centrifugación de la muestra: se centrifuga la muestra y se obtiene un sedimento o
Pellet y un sobrenadante
3. Eliminación del sobrenadante: eliminar la fracción líquida sobrenadante con una pipeta
pasteur. Con esto se eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina
4. Conservación del sedimento: entonces continuaremos el proceso de extracción de los
ácidos nucleicos. En el sedimento habrán quedado los leucocitos
Este pretratamiento también es cálido para muestras de médula ósea
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEADAS DE SANGRE PERIFÉRICA
La sangre se puede utilizar también como material de partida para detectar, aislar y
estudiar los ácidos nucleicos de algunos retrovirus que infectan linfocitos como el VIH o los
virus linfotrópicos de las células T (HTLV)
En estos casos interesa aislar las células mononucleadas de sangre periférica o PBMC
(Peropmeaal Blood Mononuclear Cell), es decir, linfocitos y monocitos antes de extraer
ácidos nucleicos. Esto se consigue mediante una centrifugación en gradiente de
densidad que requiere un medio de separación:
, 1. Se coloca en un tubo el medio de separación y encima la sangre
2. Se centrifuga durante 20-30min a 400-800 xg
a. Polisucrosa (polisacárido componente del medio de separación): causa
agergación de los hematíes facilitando su rápida sedimentación
b. Granulocitos: con una densidad mayor que el medio de separación
sedimentan también en el fondo del tubo
c. Células mononucleadas: tienen una densidad menor que el medio de
separación y permanecen en la interfase entre este y el plasma
3. Una vez eliminado el plasma sobrenadante la capa de células mononucleadas se
aspira cuidadosamente con una pipeta pasteur, se transfiera a un tubo limpio y se
lava con tampón o solución salina para eliminar los restos de plasma y plaquetas
4. A partir de las células lavadas se puede continuar con el proceso de extracción
2.2 CULTIVOS CELULARES
Son métodos de obtención de células in vitro mediante siembras controladas en medios
adecuados
Son un buen material de partida para realizar estudios genómicos y de expresión génica
en determinadas condiciones y bajo ciertos estímulos
El pretratamiento de estas muestras consiste en la recolección de las células antes de
seguir con la extracción de ácidos nucleicos
Cultivos en suspensión
1. Recolectar en un tubo
2. Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación
3. Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de iniciar la extracción y
purificación de ADN/ARN
Cultivos en monocapa
1. Usar el propio frasco para continuar el proceso de extracción
a. Retirar del frasco el medio de cultivo
b. Lavar la monocapa con tampón o solución salina
c. Iniciar in situ en el propio frasco el procedimiento de extracción
2. Pasar la monocapa a un tubo
a. Despegar la monocapa de células de la pared del frasco:
i. De forma mecánica con raspador
ii. Por medios enzimáticos: tras retirar el medio de cultivo del frasco y
lavar la monocapa con tampón de solución salina se incuban las
células con una solución de tripsina
3. Recolectar las células en un tubo
4. Lavar las células antes de continuar con la extracción
1. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN: LA PRIMERA ETAPA
Los ácidos nucleicos se encuentran confinados en el interior de las células, bien en el
núcleo, en el seno del citoplasma o en orgánulos celulares como mitocondrias y
cloroplastos
Membranas celulares: son las estructuras que limitan a la célula y además le permiten
tener relación con el medio exterior. Químicamente están constituidas por una bicapa
lipídica en cuyo seno se encuentra dispersa una gran variedad de proteínas
Pared celular: peculiaridad común a bacterias, levaduras, hongos y células vegetales es
una capa que recubre la membrana celular y proporciona rigidez y protección a las
células. Químicamente su composición es variable según el tipo de organismo que se trate
Las membranas y paredes constituyen una verdadera barrera que se deberá vencer si
queremos tener acceso a los ácidos nucleicos. Por esto su análisis y manipulación
mediante técnicas de biología molecular comporta en la mayor parte de los casos una
primera etapa de extracción y purificación
• Con la extracción conseguimos accesibles los ácidos nucleicos a los reactivos y
enzimas que se emplean en las diversas técnicas; la purificación eliminamos las
sustancias y elementos que pueden interferir en ellos
La obtención de los ácidos nucleicos purificados a partir de una muestra biológica se sele
llevar a cabo mediante un uno protocolo técnico continuado
1. Pretratamiento de la muestra
2. Extracción de los ácidos nucleicos
3. Purificación de los ácidos nucleicos
2. PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS
Los ácidos nucleicos se pueden obtener prácticamente de cualquier muestra biológica.
Pero dada la gran diversidad y variabilidad del posible material de partida en muchas
ocasiones se requiere un pretratamiento específico de la muestra biológica que permite
obtener las suspensiones celulares sobre los que se realizara la extracción y purificación de
ácidos nucleicos
Suspensiones celulares: formada por células libres y agregados celulares que flotan en el
seno de un medio líquido
,2.1 SANGRE
La sangre es una de las muestras biológicas más habituales para estudiar los ácidos
nucleicos de un individuo purificándolos a partir de uno de sus componentes celulares, los
leucocitos. Muchos de los componentes sanguíneos interfieren en las técnicas de biología
molecular. El grupo hemo de la hemoglobina es un potente inhibidor de la PCR por lo que
un objetivo común en los distintos pretratamientos es la eliminación de la hemoglobina por
medio de la lisis de los hematíes
CONSIDERACIONES SOBRE LA OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA
Para la obtención de ácidos nucleicos en una muestra de sangre lo ideal es partir de
sangre total anticoagulada con EDTA, pero la heparina y el citrato sódico también se
pueden usar como anticoagulante
La extracción de ácidos nucleicos es conveniente realizarlas en las 24h siguientes a la
obtención de la muestra, pero en caso contrario se puede conservar en refrigeración a
4ºC durante 5 días. Sin embargo, si se van a aplicar técnicas que requieren moléculas
intactas de ADN sin fragmentar como el Shouthern blot la sangre no debería almacenarse
en nevera más de 3 días
LISIS DE LOS HEMATÍES
1.Lisis de los hematíes: consiste en romper los hematíes con una solución o tampón lisis,
actualmente hay muchas soluciones lisis comerciales la mayoría de ellas basadas en
fenómenos o en detergentes suaves
2. Centrifugación de la muestra: se centrifuga la muestra y se obtiene un sedimento o
Pellet y un sobrenadante
3. Eliminación del sobrenadante: eliminar la fracción líquida sobrenadante con una pipeta
pasteur. Con esto se eliminarán los componentes del plasma sanguíneo y la hemoglobina
4. Conservación del sedimento: entonces continuaremos el proceso de extracción de los
ácidos nucleicos. En el sedimento habrán quedado los leucocitos
Este pretratamiento también es cálido para muestras de médula ósea
OBTENCIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEADAS DE SANGRE PERIFÉRICA
La sangre se puede utilizar también como material de partida para detectar, aislar y
estudiar los ácidos nucleicos de algunos retrovirus que infectan linfocitos como el VIH o los
virus linfotrópicos de las células T (HTLV)
En estos casos interesa aislar las células mononucleadas de sangre periférica o PBMC
(Peropmeaal Blood Mononuclear Cell), es decir, linfocitos y monocitos antes de extraer
ácidos nucleicos. Esto se consigue mediante una centrifugación en gradiente de
densidad que requiere un medio de separación:
, 1. Se coloca en un tubo el medio de separación y encima la sangre
2. Se centrifuga durante 20-30min a 400-800 xg
a. Polisucrosa (polisacárido componente del medio de separación): causa
agergación de los hematíes facilitando su rápida sedimentación
b. Granulocitos: con una densidad mayor que el medio de separación
sedimentan también en el fondo del tubo
c. Células mononucleadas: tienen una densidad menor que el medio de
separación y permanecen en la interfase entre este y el plasma
3. Una vez eliminado el plasma sobrenadante la capa de células mononucleadas se
aspira cuidadosamente con una pipeta pasteur, se transfiera a un tubo limpio y se
lava con tampón o solución salina para eliminar los restos de plasma y plaquetas
4. A partir de las células lavadas se puede continuar con el proceso de extracción
2.2 CULTIVOS CELULARES
Son métodos de obtención de células in vitro mediante siembras controladas en medios
adecuados
Son un buen material de partida para realizar estudios genómicos y de expresión génica
en determinadas condiciones y bajo ciertos estímulos
El pretratamiento de estas muestras consiste en la recolección de las células antes de
seguir con la extracción de ácidos nucleicos
Cultivos en suspensión
1. Recolectar en un tubo
2. Eliminar el medio de cultivo mediante centrifugación
3. Lavar las células con tampón o suero fisiológico antes de iniciar la extracción y
purificación de ADN/ARN
Cultivos en monocapa
1. Usar el propio frasco para continuar el proceso de extracción
a. Retirar del frasco el medio de cultivo
b. Lavar la monocapa con tampón o solución salina
c. Iniciar in situ en el propio frasco el procedimiento de extracción
2. Pasar la monocapa a un tubo
a. Despegar la monocapa de células de la pared del frasco:
i. De forma mecánica con raspador
ii. Por medios enzimáticos: tras retirar el medio de cultivo del frasco y
lavar la monocapa con tampón de solución salina se incuban las
células con una solución de tripsina
3. Recolectar las células en un tubo
4. Lavar las células antes de continuar con la extracción
