Samenvatting hoorcollege 4
Om eiwitten uit het membraan te zuiveren kunnen detergents gebruikt worden. Detergents
breken dus membranen op en lossen de membraaneiwitten op. Het verschil tussen lipiden en
detergents is dat detergentia als monomeer snel kunnen uitwisselen, lipiden kunnen dit niet
(zijn te hydrofoob). De detergents kunnen voorkomen in zowel monomeren als micellen. Op
de CMC (critical concentration) gaan de detergents micellen vormen i.p.v. monomeren (zie
linker grafiek)
Het nadeel van het gebruik van deze eiwitten is dat ze niet
in hun native lipiden omgeving zijn, waardoor ze kunnen
destabiliseren. Beter is dus om een membraaneiwit in een
bilaag te reconstrueren.
Dit kan door de volgende stappen:
1. Eiwit uit membraan halen met detergentia
2. Het eiwit zuiveren
3. Nieuwe fosfolipiden ook oplossen in detergentia
4. Nieuwe fosfolipide oplossen met gezuiverd eiwit
5. Detergentia weghalen m.b.v. dialyse
6. Lipiden gaan vanzelf in de energetisch meest gunstige
vorm zitten en er wordt dus een bilaag vesikel gevormd
waarin de eiwitten zitten.
Voordelen van deze methode t.o.v. micellen:
Een bilaag is representatiever voor het membraan dan detergentia
Andere soorten dingen kunnen bestudeert worden (zoals transport)
De lipide samenstelling kan worden gecontroleerd
Het binnen- en buitenmilieu kan worden gevarieerd.
Verschillen met het ‘echte membraan’:
Geen asymmetrie van eiwitten en lipiden
Andere eigenschappen (positie, curviture, dynamiek etc.)
Een alternatief model systeem zijn nanodiscs. Bij deze methode wordt eigenlijk een stuk
membraan gepakt en geïsoleerd waardoor je een ‘plakje’ membraan krijgt. Omdat dan een
stuk van de vetzuurstaarten naar buiten staat, worden de nanodiscs gestabiliseerd door
amfipatische moleculen. Er zijn twee soorten amfipatische moleculen die gebruikt worden
voor nanodiscs:
, MSP nanodiscs (100-1000 nm)
Bij deze nanodiscs zit er een membrane scaffolding protein (MSP) om de nanodisc heen.
Deze eiwitten bestaan uit alfa-helixen (X en X+4) die amfipatische zijn. Apolipo-eiwitten
(eiwitten die lipiden binden) zijn de perfecte basis voor MSP’s. De diameter van de disc
kan worden gevarieerd en tags kunnen worden aangebracht voor zuivering of visualisatie.
MSP nanodisc worden op bijna
dezelfde manier gemaakt als de bilaag
vesikels, alleen wordt naast in
detergentia opgeloste lipiden ook in
detergentia opgeloste MSP’s
toegevoegd. Hierna worden de
detergentia weer verwijdert en worden
nanodiscs gevormd.
Problemen bij deze methode zijn alleen:
Risico op (gedeeltelijke) denaturatie
Moeilijk te hanteren methode
Verlies van native interacties.
Het voordeel is dan weer dat je een specifieke lipiden samenstelling kan kiezen.
SMA nanodiscs (10-20 nm)
Bij deze nanodiscs wordt gebruikt gemaakt van een amfipatische polymeer van styreen
maileic acid copolymeren (SMA). Dit polymeer is hetrogeen in lengte. Het voordeel t.o.v.
MSP nanodiscs is dat ze direct uit het native membraan kunnen worden gehaald terwijl bij
MSP het eiwit eerst uit het membraan gehaald moet worden.
Voordelen nanodiscs t.o.v. vesikels:
Klein van stuk, bruikbaar
voor veel verschillende technieken
Aantal eiwitten dat aggregeert kan worden gecontroleerd
Toegang tot het eiwit van beide kanten
Voordelen van vesikels t.o.v. nanodiscs:
Gesloten systeem bruikbaar voor transport studies
De grote van de vesikel en de membraan curviture kan worden gevarieerd
Eiwitten met een grote dwarsdoorsnede kunnen worden geïncorporeerd
Processen waarbij laterale diffusie is betrokken kunnen worden bestudeerd
(assosiatie/dissociatie)
Om eiwitten uit het membraan te zuiveren kunnen detergents gebruikt worden. Detergents
breken dus membranen op en lossen de membraaneiwitten op. Het verschil tussen lipiden en
detergents is dat detergentia als monomeer snel kunnen uitwisselen, lipiden kunnen dit niet
(zijn te hydrofoob). De detergents kunnen voorkomen in zowel monomeren als micellen. Op
de CMC (critical concentration) gaan de detergents micellen vormen i.p.v. monomeren (zie
linker grafiek)
Het nadeel van het gebruik van deze eiwitten is dat ze niet
in hun native lipiden omgeving zijn, waardoor ze kunnen
destabiliseren. Beter is dus om een membraaneiwit in een
bilaag te reconstrueren.
Dit kan door de volgende stappen:
1. Eiwit uit membraan halen met detergentia
2. Het eiwit zuiveren
3. Nieuwe fosfolipiden ook oplossen in detergentia
4. Nieuwe fosfolipide oplossen met gezuiverd eiwit
5. Detergentia weghalen m.b.v. dialyse
6. Lipiden gaan vanzelf in de energetisch meest gunstige
vorm zitten en er wordt dus een bilaag vesikel gevormd
waarin de eiwitten zitten.
Voordelen van deze methode t.o.v. micellen:
Een bilaag is representatiever voor het membraan dan detergentia
Andere soorten dingen kunnen bestudeert worden (zoals transport)
De lipide samenstelling kan worden gecontroleerd
Het binnen- en buitenmilieu kan worden gevarieerd.
Verschillen met het ‘echte membraan’:
Geen asymmetrie van eiwitten en lipiden
Andere eigenschappen (positie, curviture, dynamiek etc.)
Een alternatief model systeem zijn nanodiscs. Bij deze methode wordt eigenlijk een stuk
membraan gepakt en geïsoleerd waardoor je een ‘plakje’ membraan krijgt. Omdat dan een
stuk van de vetzuurstaarten naar buiten staat, worden de nanodiscs gestabiliseerd door
amfipatische moleculen. Er zijn twee soorten amfipatische moleculen die gebruikt worden
voor nanodiscs:
, MSP nanodiscs (100-1000 nm)
Bij deze nanodiscs zit er een membrane scaffolding protein (MSP) om de nanodisc heen.
Deze eiwitten bestaan uit alfa-helixen (X en X+4) die amfipatische zijn. Apolipo-eiwitten
(eiwitten die lipiden binden) zijn de perfecte basis voor MSP’s. De diameter van de disc
kan worden gevarieerd en tags kunnen worden aangebracht voor zuivering of visualisatie.
MSP nanodisc worden op bijna
dezelfde manier gemaakt als de bilaag
vesikels, alleen wordt naast in
detergentia opgeloste lipiden ook in
detergentia opgeloste MSP’s
toegevoegd. Hierna worden de
detergentia weer verwijdert en worden
nanodiscs gevormd.
Problemen bij deze methode zijn alleen:
Risico op (gedeeltelijke) denaturatie
Moeilijk te hanteren methode
Verlies van native interacties.
Het voordeel is dan weer dat je een specifieke lipiden samenstelling kan kiezen.
SMA nanodiscs (10-20 nm)
Bij deze nanodiscs wordt gebruikt gemaakt van een amfipatische polymeer van styreen
maileic acid copolymeren (SMA). Dit polymeer is hetrogeen in lengte. Het voordeel t.o.v.
MSP nanodiscs is dat ze direct uit het native membraan kunnen worden gehaald terwijl bij
MSP het eiwit eerst uit het membraan gehaald moet worden.
Voordelen nanodiscs t.o.v. vesikels:
Klein van stuk, bruikbaar
voor veel verschillende technieken
Aantal eiwitten dat aggregeert kan worden gecontroleerd
Toegang tot het eiwit van beide kanten
Voordelen van vesikels t.o.v. nanodiscs:
Gesloten systeem bruikbaar voor transport studies
De grote van de vesikel en de membraan curviture kan worden gevarieerd
Eiwitten met een grote dwarsdoorsnede kunnen worden geïncorporeerd
Processen waarbij laterale diffusie is betrokken kunnen worden bestudeerd
(assosiatie/dissociatie)
