Samenvatting research strategies in microbiology
Thema 1: Modulatie van de immuunrespons door S. aureus
1. Een beschrijving geven van een onderzoeksstrategie voor het onderzoek naar anti-
inflammatoire producten van bacteriën
2. Receptor-ligand binding assays op cellen, flow cytometrie experimenten en meting van
antistof titers en eiwitten beschrijven en data hiervan analyseren en interpreteren
3. Bestaande kennis uit de literatuur toepassen in de opzet en analyse van onderzoek naar
eiwitten afkomstig van Stafylokokken
4. Een beschrijving van de volgende microbiologische concepten; immunologische
ontwijkingsstrategieën van micro-organismen, pathogenicity island, virulentiefactoren en
daarbij voorbeelden noemen bij Stafylokokken
5. De immunologische mechanismen, tijdens de ontstekingsproces, van fagocytose en
opsonisatie benoemen
Flow-cytometrie:
- Cellen worden gelabeld met specifieke antistoffen gericht tegen celmembraan eiwitten (Ag).
Alle antistoffen krijgen een andere kleur fluorescent label. Bij de meting komt er een single
cel stroom door een opening die langs een laser komt. De laser detecteert de fluorescentie
en mate van granulariteit van de cellen. Hieruit komt een scatterplot (dotplot) of histogram.
- Wordt gebruikt voor het identificeren en/ of isoleren van cellen of eiwitten.
Forward scatter is voor de grootte van de cellen en de side is voor de mate
van granulariteit.
Identificatie en isolatie van cel populatie kan gedaan worden met flow-
cytometrie.
- Bijvoorbeeld B en T cellen worden onderscheiden in een gemengde
lymfocyten populatie door de lymfocyten specifiek te kleuren voor
IgM (B-cel receptor) of de T-cel receptor
Om bijvoorbeeld te onderzoeken hoeveel cellen binden aan CHIPS kan je de
cellen allemaal een fluorescent label geven en de CHIPS zelf ook een label.
Wanneer je dan de cellen door een flowcytometer haalt kan je op basis van
deze fluorescentie bepalen hoeveel cellen er zijn gebonden.
Alleen kan je zo geen onderscheid maken in welke cellen het precies zijn.
Hiervoor moeten specifieke celmembraan eiwitten gebruikt worden zoals
bijvoorbeeld CD14.
Gebruik van twee kleuren:
- Kan gebruikt worden wanneer je
bijvoorbeeld 2 verschillende receptoren op
en cel wil onderzoeken.
- Wanneer je deze in een dotplot tegen
elkaar uit zet kunnen populaties
gedefinieerd worden.
1
,Gating: Het gemiddelde en de mediaan van subpopulaties bepalen. In een scatterplot maak je een
cirkel om de cellen van interesse heen. Daarna wordt van dat stukje opnieuw de fluorescentie
gemeten (is in principe al gedaan maar de computer berekent dit dan opnieuw met alleen dat
stukje). Daarvan kan weer een aparte histogram gemaakt
worden.
- Histogram heeft altijd een logaritmische schaal.
- Wanneer de spreiding van een piek in een
histogram te groot is, is de uitkomst minder
betrouwbaar. Daarom worden histogrammen
altijd nog bekeken en worden waardes niet
zomaar overgenomen vanuit het systeem.
Manieren waarop een bacterie het ontstekingsproces kan beïnvloeden:
- Bacterie kan een eiwit maken (toxine) met een specifieke werking
- Bijvoorbeeld CHIPS bij stafylokokken
CHIPS: chemotaxis inhibitory protein staphylococcus aureus.
- Binden aan de monocyten en de granulocyten (vanwege C5a receptoren)
- Is een specifieke binding van de CHIPS aan de monocyten en neutrofielen
Ontwijking strategieën van micro-organismen:
- Zich verstoppen in gastheercellen
- Modulatie van de immuunrespons stafylokokken
- Antigeen variatie
o Binnen de gastheer
geen herkenning meer door effector functie
o Binnen populaties
geen herkenning meer door effector functie
o Shedding van antigenen
Verstoring van effectorfunctie van antistoffen
o Moleculaire mimicry
Verstoring van effectorfunctie van antistoffen
o Verbergen van functionele antigenen
Verstoring van effectorfunctie van antistoffen
o Afbraak van antistoffen of complement factoren
Verstoring van effectorfunctie van antistoffen
Chemotaxis: de verplaatsing van organismen als gevolg van een concentratie van bepaalde stoffen in
de omgeving.
2
,De ontstekingsreactie:
Cellen van de aangeboren afweer:
- Granulocyten
- Monocyten/ macrofagen
- Dendritische cellen
- Neutrofielen
Aangeboren afweer:
1. Bacterie komt de huid binnen bij een wondje en gaat vermenigvuldigen.
2. Het complement systeem wordt geactiveerd. C5a
a. C5a zorgt voor chemotaxis, aantrekken van granulocyten vanuit de bloedbaan
b. Adhesie van de granulocyt ontstaat op de wand van de bloedvaten
3. Door chemotaxis van C5a wordt de granulocyt naar de bacterie toe geleidt.
4. De granulocyt wordt geactiveerd zodra er een hoog genoeg concentratie C5a is.
5. Fagocytose van de bacterie vindt daarna plaats
Eiwitten van de humane afweer die van belang zijn (3 componenten van het complement systeem):
- Labelen van de bacterie (opsonisatie) C3b
- Chemotaxis C5a
- Lysis van gram-negatieve bacteriën C5b-9 complex
Neutrofielen en macrofagen hebben een receptor voor C5a geactiveerde chemotaxis.
- C3a en C5a verhogen de inflammatoire respons door binding aan mestcellen, deze laten
daardoor histamine vrij, wat neutrofielen sterk aantrekt.
Meting van receptor expressie m.b.v. flowcytometrie:
3
, Vaak vind je in de legenda van een figuur de conclusie.
CHIPS zitten in het supernatant van de bacteriesuspensie. Doormiddel van kolomchromatografie kan
dit eiwit hier uit gehaald worden.
Met SDS-page kan de massa van het eiwit bepaald worden/ CHIPS geïsoleerd worden.
ELISA kan gebruikt worden om de productie van CHIPS in vivo te onderzoeken door het gebruik van
antistoffen (mAb).
Een andere methode om gezuiverde eiwitten te verkrijgen is doormiddel van recombinant DNA
techniek. Wanneer het gen beschikbaar is kan deze in het DNA van andere bacteriën geplaatst
worden en dan kan de bacterie dit zelf gaan aanmaken waaruit het weer geïsoleerd kan worden.
Transwell migration assay:
Wordt gebruikt voor een kwantitatieve bepaling van de invloeden van
verschillende factoren op celmigratie (bijvoorbeeld chemotaxis).
- In het artikel werd de transwell migration assay gebruikt voor
het onderzoeken van de receptor expressie en chemotaxis.
- Door de migratie van het eiwit door het micro poreuze
membraan te meten door bijvoorbeeld aantrekking van een chemo-attractant.
- Wanneer de chemotaxis wordt verhinderd door een toegevoegde stof aan de cellen (van
tevoren geïncubeerd) is er geen migratie te meten door het membraan heen.
- Het mengsel in het onderste compartiment kan gemeten worden met flowcytometrie.
Onderzoek naar het gen van een eiwit: chemisch kan onderzocht worden welke aminozuren er in
zitten. Wanneer je de aminozuren weet, kan de tripletcode onderzocht worden. Door daarna met
verschillende primers voor de verschillende tripletcodes te PCR’en kan het gen van het eiwit
gevonden worden.
Afkomst van virulentie genen in bacteriën:
- Genen zijn aanwezig op pathogene eilanden
o Groep genen op “eilanden” die bacteriën onderling kunnen uitwisselen (horizontale
gen overdracht)
- Mobiel genetische elementen
- Pathogene eilanden (PAI)
o Alleen aanwezig bij pathogene, virulente stammen van een bacterie species.
Virulentie genen hebben een net andere opbouw van het DNA, ze zijn vaak GC rijk.
Stel je wilt weten of CHIPS ook voorkomt bij andere S.aureus stammen. Dan onderzoek je dit door
een PCR te draaien. Dit doe je op veel verschillende stammen te testen; klinische stammen, gezonde
stammen, niet invasieve stammen en stammen die infecties geven in de bloedbaan.
Dus onderzoek naar een virulent eiwit: immunologische testen moleculaire testen
dierproeven.
Efb: extracellulair fibrinogeen binding proteïne
4
Thema 1: Modulatie van de immuunrespons door S. aureus
1. Een beschrijving geven van een onderzoeksstrategie voor het onderzoek naar anti-
inflammatoire producten van bacteriën
2. Receptor-ligand binding assays op cellen, flow cytometrie experimenten en meting van
antistof titers en eiwitten beschrijven en data hiervan analyseren en interpreteren
3. Bestaande kennis uit de literatuur toepassen in de opzet en analyse van onderzoek naar
eiwitten afkomstig van Stafylokokken
4. Een beschrijving van de volgende microbiologische concepten; immunologische
ontwijkingsstrategieën van micro-organismen, pathogenicity island, virulentiefactoren en
daarbij voorbeelden noemen bij Stafylokokken
5. De immunologische mechanismen, tijdens de ontstekingsproces, van fagocytose en
opsonisatie benoemen
Flow-cytometrie:
- Cellen worden gelabeld met specifieke antistoffen gericht tegen celmembraan eiwitten (Ag).
Alle antistoffen krijgen een andere kleur fluorescent label. Bij de meting komt er een single
cel stroom door een opening die langs een laser komt. De laser detecteert de fluorescentie
en mate van granulariteit van de cellen. Hieruit komt een scatterplot (dotplot) of histogram.
- Wordt gebruikt voor het identificeren en/ of isoleren van cellen of eiwitten.
Forward scatter is voor de grootte van de cellen en de side is voor de mate
van granulariteit.
Identificatie en isolatie van cel populatie kan gedaan worden met flow-
cytometrie.
- Bijvoorbeeld B en T cellen worden onderscheiden in een gemengde
lymfocyten populatie door de lymfocyten specifiek te kleuren voor
IgM (B-cel receptor) of de T-cel receptor
Om bijvoorbeeld te onderzoeken hoeveel cellen binden aan CHIPS kan je de
cellen allemaal een fluorescent label geven en de CHIPS zelf ook een label.
Wanneer je dan de cellen door een flowcytometer haalt kan je op basis van
deze fluorescentie bepalen hoeveel cellen er zijn gebonden.
Alleen kan je zo geen onderscheid maken in welke cellen het precies zijn.
Hiervoor moeten specifieke celmembraan eiwitten gebruikt worden zoals
bijvoorbeeld CD14.
Gebruik van twee kleuren:
- Kan gebruikt worden wanneer je
bijvoorbeeld 2 verschillende receptoren op
en cel wil onderzoeken.
- Wanneer je deze in een dotplot tegen
elkaar uit zet kunnen populaties
gedefinieerd worden.
1
,Gating: Het gemiddelde en de mediaan van subpopulaties bepalen. In een scatterplot maak je een
cirkel om de cellen van interesse heen. Daarna wordt van dat stukje opnieuw de fluorescentie
gemeten (is in principe al gedaan maar de computer berekent dit dan opnieuw met alleen dat
stukje). Daarvan kan weer een aparte histogram gemaakt
worden.
- Histogram heeft altijd een logaritmische schaal.
- Wanneer de spreiding van een piek in een
histogram te groot is, is de uitkomst minder
betrouwbaar. Daarom worden histogrammen
altijd nog bekeken en worden waardes niet
zomaar overgenomen vanuit het systeem.
Manieren waarop een bacterie het ontstekingsproces kan beïnvloeden:
- Bacterie kan een eiwit maken (toxine) met een specifieke werking
- Bijvoorbeeld CHIPS bij stafylokokken
CHIPS: chemotaxis inhibitory protein staphylococcus aureus.
- Binden aan de monocyten en de granulocyten (vanwege C5a receptoren)
- Is een specifieke binding van de CHIPS aan de monocyten en neutrofielen
Ontwijking strategieën van micro-organismen:
- Zich verstoppen in gastheercellen
- Modulatie van de immuunrespons stafylokokken
- Antigeen variatie
o Binnen de gastheer
geen herkenning meer door effector functie
o Binnen populaties
geen herkenning meer door effector functie
o Shedding van antigenen
Verstoring van effectorfunctie van antistoffen
o Moleculaire mimicry
Verstoring van effectorfunctie van antistoffen
o Verbergen van functionele antigenen
Verstoring van effectorfunctie van antistoffen
o Afbraak van antistoffen of complement factoren
Verstoring van effectorfunctie van antistoffen
Chemotaxis: de verplaatsing van organismen als gevolg van een concentratie van bepaalde stoffen in
de omgeving.
2
,De ontstekingsreactie:
Cellen van de aangeboren afweer:
- Granulocyten
- Monocyten/ macrofagen
- Dendritische cellen
- Neutrofielen
Aangeboren afweer:
1. Bacterie komt de huid binnen bij een wondje en gaat vermenigvuldigen.
2. Het complement systeem wordt geactiveerd. C5a
a. C5a zorgt voor chemotaxis, aantrekken van granulocyten vanuit de bloedbaan
b. Adhesie van de granulocyt ontstaat op de wand van de bloedvaten
3. Door chemotaxis van C5a wordt de granulocyt naar de bacterie toe geleidt.
4. De granulocyt wordt geactiveerd zodra er een hoog genoeg concentratie C5a is.
5. Fagocytose van de bacterie vindt daarna plaats
Eiwitten van de humane afweer die van belang zijn (3 componenten van het complement systeem):
- Labelen van de bacterie (opsonisatie) C3b
- Chemotaxis C5a
- Lysis van gram-negatieve bacteriën C5b-9 complex
Neutrofielen en macrofagen hebben een receptor voor C5a geactiveerde chemotaxis.
- C3a en C5a verhogen de inflammatoire respons door binding aan mestcellen, deze laten
daardoor histamine vrij, wat neutrofielen sterk aantrekt.
Meting van receptor expressie m.b.v. flowcytometrie:
3
, Vaak vind je in de legenda van een figuur de conclusie.
CHIPS zitten in het supernatant van de bacteriesuspensie. Doormiddel van kolomchromatografie kan
dit eiwit hier uit gehaald worden.
Met SDS-page kan de massa van het eiwit bepaald worden/ CHIPS geïsoleerd worden.
ELISA kan gebruikt worden om de productie van CHIPS in vivo te onderzoeken door het gebruik van
antistoffen (mAb).
Een andere methode om gezuiverde eiwitten te verkrijgen is doormiddel van recombinant DNA
techniek. Wanneer het gen beschikbaar is kan deze in het DNA van andere bacteriën geplaatst
worden en dan kan de bacterie dit zelf gaan aanmaken waaruit het weer geïsoleerd kan worden.
Transwell migration assay:
Wordt gebruikt voor een kwantitatieve bepaling van de invloeden van
verschillende factoren op celmigratie (bijvoorbeeld chemotaxis).
- In het artikel werd de transwell migration assay gebruikt voor
het onderzoeken van de receptor expressie en chemotaxis.
- Door de migratie van het eiwit door het micro poreuze
membraan te meten door bijvoorbeeld aantrekking van een chemo-attractant.
- Wanneer de chemotaxis wordt verhinderd door een toegevoegde stof aan de cellen (van
tevoren geïncubeerd) is er geen migratie te meten door het membraan heen.
- Het mengsel in het onderste compartiment kan gemeten worden met flowcytometrie.
Onderzoek naar het gen van een eiwit: chemisch kan onderzocht worden welke aminozuren er in
zitten. Wanneer je de aminozuren weet, kan de tripletcode onderzocht worden. Door daarna met
verschillende primers voor de verschillende tripletcodes te PCR’en kan het gen van het eiwit
gevonden worden.
Afkomst van virulentie genen in bacteriën:
- Genen zijn aanwezig op pathogene eilanden
o Groep genen op “eilanden” die bacteriën onderling kunnen uitwisselen (horizontale
gen overdracht)
- Mobiel genetische elementen
- Pathogene eilanden (PAI)
o Alleen aanwezig bij pathogene, virulente stammen van een bacterie species.
Virulentie genen hebben een net andere opbouw van het DNA, ze zijn vaak GC rijk.
Stel je wilt weten of CHIPS ook voorkomt bij andere S.aureus stammen. Dan onderzoek je dit door
een PCR te draaien. Dit doe je op veel verschillende stammen te testen; klinische stammen, gezonde
stammen, niet invasieve stammen en stammen die infecties geven in de bloedbaan.
Dus onderzoek naar een virulent eiwit: immunologische testen moleculaire testen
dierproeven.
Efb: extracellulair fibrinogeen binding proteïne
4
