Samenvatting moleculaire microbiologie

Samenvatting moleculaire microbiologie

Les 1 en 2: PCR; ontwerpen van een valide test.

Heeft kennis en begrip van synthese en structuur van nucleïnezuren

Structuur van DNA nucleotiden:
- Fosfaatgroep (buitenkant)
- Suikergroep (midden)
- Base (binnenkant)

Purines: Adenine (A) en Guanine (G)
Pyrimidines: Thymine (T) en Cytosine (C)

3 nucleotiden samen heten een triplet of codon  coderen samen voor een specifiek aminozuur
- Aminozuren zijn de bouwstenen van eiwitten.

Een purine bindt altijd aan een pyrimidine en andersom.
- A bindt aan T met twee waterstofbruggen
- G bindt aan C met drie waterstofbruggen
o Is belangrijk voor de smelttemperatuur tijdens een PCR reactie

Waterstofbruggen zorgen voor stabilisatie tussen de basen maar kun je gemakkelijk verbreken door
te verhitten.

DNA strengen liggen in tegenovergestelde richting en anti-parallel (reverse complement).
- 5’  3’
- 3’  5’

DNA vs. RNA:
- DNA heeft een deoxyribose en RNA heeft een ribose
- DNA heeft 2 strengen, RNA 1 streng
- DNA heeft thymine en RNA uracil

Transcriptie-translatie in prokaryoten:
- Er komt een signaal dat RNA polymerase actief moet worden bij een
bepaald gen zodat een eiwit wat nodig is wordt gemaakt. Waardoor een
RNA streng met verschillende tripletten wordt gemaakt. Doormiddel van
ribosomen en tRNA worden polypeptidenmoleculen (eiwitten) gemaakt.

Kan de verschillende componenten van een PCR mix benoemen

PCR en Q-PCR worden gebruikt als identificatie methode op een moleculair lab.
- Soort specifieke amplificatie van het 16s rDNA gen.
- Amplificatie van soort-specifieke genen (virulentie factoren)
- Amplificatie van familie-specifieke DNA fragmenten (huishoud genen)
- Amplificatie van resistente genen (MICA-PCR)
- Amplificatie van het hele genoom



1

,Conserved regionen: niet-specifieke regionen, zijn nodig voor de functie van het eiwit
- Kunnen niet gebruikt worden voor identificatie.

Variabele regionen: groep of soort specifieke regionen, zijn niet nodig voor de functie van het eiwit
en daarom kan hier gemakkelijk een mutatie plaatsvinden.
- Kunnen wel gebruikt worden voor identificatie

Reverse transcriptase: van RNA cDNA maken.
- RNA moet daarvoor wel eerst denatureren en daarna moet het meteen op ijs. Hierdoor blijft
hij lineair.

Laboratorium vereisten voor PCR detectie van specifieke sequenties:
- Er zijn minimaal 3 verschillende laboratorium ruimtes nodig:
o Ruimte 1: de schone ruimte  voor het maken van de mixen
o Ruimte 2: het lab voor het mixen van de mixen met de monsters
o Ruimte 3: de PCR ruimte.
o Soms een 4e ruimte voor het openen van epjes om contaminatie te kunnen
voorkomen.
Je mag nooit van een volgende ruimte terugkeren naar een van de eerdere ruimtes. Dit heeft te
maken met contaminatie.

Voordat je een PCR kan ontwerpen moet je weten of de target DNA of RNA is en wat de sequentie is
voor het maken van de primers.

Onderdelen van een PCR mix:
1. Target van het DNA (gezuiverd)
2. Alle 4 de dNTP’s (A,T,G,C)
a. 20 tot 200uM van alle 4
b. Een te hoge concentratie kan synthesefouten veroorzaken
3. PCR buffer:
a. Tris-HCL buffer met pH 7,8
b. Optioneel zijn: Tween (stabiliseert Taq), BSA, eenwaardige ionen
4. Taq-DNA polymerase
5. MgCl2, is een essentiële co-factor voor taq en heeft een stabiliserend effect
6. Primers/ probes

Taq-DNA-polymerase (thermus aquaticus)
- Essentieel is dat dit hittestabiel is.
- Geeft een snelle synthese
- Nadeel; is gevoelig voor allerlei remmende stoffen (die bijvoorbeeld in patiënten materiaal
zitten)
- Heeft geen 3’ 5’ exonucleoase activitiet en dus geen proofreading
o Is dus niet handig om te gebruiken als je een bepaald gen wil isoleren
o Heeft wel 5’  3’ exonucleoase (is belangrijk voor een taqman)

Remmende stoffen van taq-polymerase: ( erg belangrijk om goed en netjes te zuiveren!)
- Proteolytische enzymen
- Heparine, ijzerionen (bloed)
- DMSO in hoge concentraties
- Urine componenten en hoge zoutconcentraties
- SDS (zeepachtig)

2

, - Ureum
Herkent sense en anti-sense sequenties

Sense sequentie: codeert vaan het RNA dat betrokken is bij de vorming van eiwitten.
- 3’  5’

Anti-sense sequentie: de niet coderende streng welke complementair is aan de coderende streng.
- 5’ 3’

Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moet voldoen

Voorwaarden voor primers:
- Ongeveer tussen de 18- 25 nucleotiden
o Is belangrijk voor de specificiteit van de binding en voor de annealing.
- Primerpaar: vergelijkbaar hoog CG gehalte (40-70%)
- Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
o Bij annealing moeten de strengen dubbelstrengs zijn zodat eerst de primers kunnen
binden.
o Temperatuur zit ongeveer 10 graden onder de smelttemperatuur van het DNA.
- Er mag geen baseparing mogelijk zijn in de primer zelf of tussen de twee primers (primer-
dimeer)
- Amplicon bij voorkeur 75-200 basenparen voor de hoogste efficiëntie.
- Smelttemperatuur (Tm) tussen de 50 en 65 graden Celsius

Een primer is goed wanneer polymerase aan de 3’ kant 2 strengen kan binden.




De Tm van een primer kan je indien nodig nog verder verhogen door een base toe te voegen aan de
streng.

Voorwaarden van een probe:
- Probe moet eerder binden op het DNA dan de primers (Tm is ongeveer 60-70 graden)
o Tm moet hoog zijn omdat er anders geen signaal ontstaat
- GC-gehalte moet tussen de 20 en 80% zijn
- En mag geen lange herhaling van nucleotide in de probe zitten
- Er mogen geen G’s aan de 5’ kant zitten aangezien dit kan leiden tot extra quenching.
- Er moeten meer C’s zijn dan G’s.




3