Metabolisme hoofdstuk 9
De bindingsenergie die vrijkomt als een enzym bindt aan zijn substraat heeft twee doelen:
1. Het resulteert in substraat specifiteit
2. Het verhoogt katalytische efficiëntie
De interactie tussen het enzym en het substraat stabiliseert de transition state waardoor de activatie
energie wordt verlaagd. De bindingsenergie kan ook structurele veranderingen in het enzym en het
substraat activeren wat de katalyse vergemakkelijkt, ook wel induced fit.
4 additionele strategieën voor katalyse specifiteit:
1. Covalente katalyse: de active site heeft een reactieve groep, deze wordt tijdelijk covalent
verbonden aan het substraat.
a. Chymotrypsine
2. General Acid-Base katalyse: een molecuul (anders dan water) speelt een rol als proton
acceptor of donor.
3. Katalyse door approximation: de reactie snelheid van twee substraten wordt verhoogd door
deze zicht bij elkaar te brengen aan hetzelfde enzym oppervlakte.
4. Metaal ion katalyse: metaal ionen kunnen bijdragen aan de formatie van nucleophiles of als
een electrophile (stabiliseert zo de negatieve ladingen van een reactie tussenproduct). Tot
slot kan een metaal ion ook de brug zijn tussen enzym en substraat door het verhogen van
de bindingsenergie en het in de juiste conformatie houden.
Proteases
Proteases knippen peptiden door middel van hydrolyse; het toevoegen van een water molecuul aan
een peptide binding. Zonder enzym zou deze katalyse een halfwaarde tijd van 10 tot 1000 jaar
hebben. De resonantie structuur die zorgt voor de planariteit van de peptide binding zorgt voor deze
hoge stabiliteit.
- Veel proteases hydrolyseren ook esters.
Chymotrypsine klieft de peptide bindingen aan de carboxylterminaal van grote hydrofobe
aminozuren (zoals tryptofaan, tryrosine, fenylalanine en methionine). De hydrofobe zijketens passen
namelijk precies in de hydrofobe S1 pocket van het enzym. De binding van de juiste zijketen in de
pocket zorgt ervoor dat de aangelegen peptide binding in de active site komt voor klieving.
Chymotrypsine is een goed voorbeeld van covalente katalyse. Het enzym gebruikt een sterke
nucleophile om de niet reactie carbonyl koolstof atoom van het substraat aan te vallen. De
nucleophile wordt kort covalent verbonden aan het substraat. Chymotrypsine bevat een
buitengewoon reactief serine residu.
Chromogenic substraat: een substraat analoog die een gekleurd product vormt, gebruikt voor het
bestuderen van de kinetics van enzymen.
Uit de stopped-flow method (mix van enzym en substraat, resulaten elke miliseconde gemeten) bleek
dat hydrolyse plaats vindt in twee stappen. Eerst vindt er een burst fase plaats, gevolgd door een
steady-state fase. Deze twee fases worden verklaard door een covalent gebonden enzym-substraat
tussenproduct.
- Eerst wordt de acylgroep van het substraat covalent verbonden aan het enzym, dit wordt het
acyl-enzyme intermediate genoemd.
- Het acyl-enzym tussenproduct wordt gehydrolyseerd waarbij een carboxyl zuurgroep en een
vrij enzym ontstaat. Deze tweede stap verloopt echter veel trager dan de eerste.
, De drie-dimensionale structuur van chymotrypsine toont aan dat het enzym ongeveer bolvormig is
en uit drie polypeptiden bestaat (gebonden door disulfide bindingen). Het eiwit is gesynthetiseerd als
chymotrypsinogen, deze wordt gekliefd waardoor de drie ketens ontstaan. De actieve site,
gemarkeerd met serine 195, ligt in een groeve aan het oppervlakte. De serine zijgroep wordt met
waterstofbruggen gebonden aan de ring van histidine 57. De NH groep van deze ring is gebonden aan
de carboxylaat groep van asparataan 102. Dit wordt de katalytische triade genoemd. Het histidine
residu zorgt ervoor dat de serine zijketen op de juiste positie ligt, daarnaast polaryseert het de
hydroxyl groep. In aanwezigheid van het substraat ontvangt het histidine residu een proton van het
serine 195 residu. Hierdoor ontstaat het alkoxide ion, dit is een veel sterkere nucleophile. Het
aspartaat residu zorgt voor het positioneren van histidine en maakt histidine een betere proton
acceptor door waterstofbruggen en elektrostatische effecten.
Na substraat binding gaat serine 195 een nucleophilische aanval aan op het carbonyl koolstof atoom
van de doelwit peptide binding. Hierdoor zijn er vier atomen verbonden aan het carbonyl atoom.
Hierdoor ontstaat het onstabiele tetrahedral intermediate. Hierdoor wordt het zuurstofatoom
negatief geleden, deze wordt gestabiliseerd door de NH groep van de oxanion hole. Het
tetrahedrische tussenproduct stort in waardoor het acyl-enzym gevormd wordt. Hierbij wordt een
proton van de positief geladen histidine groep overgedragen aan de aminogroep die ontstaat door de
klieving van de peptide binding. Het amine component laat het enzym nu los, waarna deze
geacytileerd achterblijft.
De deacetylatie begint als een water molecuul de plek inneemt van het amine substraat. Histidine
trekt nu een proton weg van het water molecuul. Hierdoor ontstaat er een OH - ion, deze valt het
carbonyl koolstof atoom van de acyl groep aan waardoor het tetrahedrische tussenproduct wordt
gevormd. Deze structuur breekt en vormt zo het carboxylzuur product. Als deze wordt losgelaten is
het enzym klaar voor de volgende katalyse.
Meer specifieke proteases hebben meer pockets voor de herkenning van meer residuen van het
substraat. Residuen aan de amino terminaal van de scissile bond (de binding die geklieft moet
worden) zijn gelabeld met P1, P2 …, met 1 het dichtste bij de binding. De residuen aan de craboxyl
zijde worden P1’, P2’ … genoemd. De bijbehorende plek op het enzym wordt S1, S1’ etc. genoemd.
Homologen van chymotrypsine:
Trypsine klieft aan de peptide binding van residuen met lange positief geladen zijketens (arginine en
lysine). Elastase knipt aan de peptide binding na residuen met korte zijketens (alanine en serine).
Verschillen in specifiteit tussen deze peptidasen wordt verklaard door structurele verschillen in de
pocket. Zo is aspartaat aanwezig in de pocket van trypsine wat positeif geladen zijktens bindt. Bij
elastase wordt de pocket deels geblokkeerd door grote zijketens van valanine.
Subtilisine is geen homoloog van chymotrypsine. Echter komt de active site sterk overeen door
convergente evolutie. Zo heeft de active site de katalytische triade en de oxyanion hole.
Daarnaast zijn er ook enkele proteases die een serine of threonine residu hebben die niet door
histidine maar door bijvoorbeeld lysine wordt geactiveerd.
De katalytische triade in proteases is dus drie keer onafhankelijk ontstaan in de evolutie.
Middels site directed mutagenesis kan gekeken worden naar de bijdrage aan de katalytische kracht
van specifieke residuen. Subtilisine is uitgebreid getest middels site directed mutagenesis. Zo is elke
aimozuur in de triade (aspartaan zuur, histidine en serine) vervangen door alanine. Vervolgens is het
functioneren van elk mutant enzym getest.
- De vervanging van serine heeft de katalytische kracht dramatisch verlaagd. De k cat verzwakte
met een miljoen keer, terwijl de KM redelijk stabiel bleef; het substraat kon dus wel normaal
binden.
- De mutatie van histidine gaf een vergelijkbaar resultaat.
De bindingsenergie die vrijkomt als een enzym bindt aan zijn substraat heeft twee doelen:
1. Het resulteert in substraat specifiteit
2. Het verhoogt katalytische efficiëntie
De interactie tussen het enzym en het substraat stabiliseert de transition state waardoor de activatie
energie wordt verlaagd. De bindingsenergie kan ook structurele veranderingen in het enzym en het
substraat activeren wat de katalyse vergemakkelijkt, ook wel induced fit.
4 additionele strategieën voor katalyse specifiteit:
1. Covalente katalyse: de active site heeft een reactieve groep, deze wordt tijdelijk covalent
verbonden aan het substraat.
a. Chymotrypsine
2. General Acid-Base katalyse: een molecuul (anders dan water) speelt een rol als proton
acceptor of donor.
3. Katalyse door approximation: de reactie snelheid van twee substraten wordt verhoogd door
deze zicht bij elkaar te brengen aan hetzelfde enzym oppervlakte.
4. Metaal ion katalyse: metaal ionen kunnen bijdragen aan de formatie van nucleophiles of als
een electrophile (stabiliseert zo de negatieve ladingen van een reactie tussenproduct). Tot
slot kan een metaal ion ook de brug zijn tussen enzym en substraat door het verhogen van
de bindingsenergie en het in de juiste conformatie houden.
Proteases
Proteases knippen peptiden door middel van hydrolyse; het toevoegen van een water molecuul aan
een peptide binding. Zonder enzym zou deze katalyse een halfwaarde tijd van 10 tot 1000 jaar
hebben. De resonantie structuur die zorgt voor de planariteit van de peptide binding zorgt voor deze
hoge stabiliteit.
- Veel proteases hydrolyseren ook esters.
Chymotrypsine klieft de peptide bindingen aan de carboxylterminaal van grote hydrofobe
aminozuren (zoals tryptofaan, tryrosine, fenylalanine en methionine). De hydrofobe zijketens passen
namelijk precies in de hydrofobe S1 pocket van het enzym. De binding van de juiste zijketen in de
pocket zorgt ervoor dat de aangelegen peptide binding in de active site komt voor klieving.
Chymotrypsine is een goed voorbeeld van covalente katalyse. Het enzym gebruikt een sterke
nucleophile om de niet reactie carbonyl koolstof atoom van het substraat aan te vallen. De
nucleophile wordt kort covalent verbonden aan het substraat. Chymotrypsine bevat een
buitengewoon reactief serine residu.
Chromogenic substraat: een substraat analoog die een gekleurd product vormt, gebruikt voor het
bestuderen van de kinetics van enzymen.
Uit de stopped-flow method (mix van enzym en substraat, resulaten elke miliseconde gemeten) bleek
dat hydrolyse plaats vindt in twee stappen. Eerst vindt er een burst fase plaats, gevolgd door een
steady-state fase. Deze twee fases worden verklaard door een covalent gebonden enzym-substraat
tussenproduct.
- Eerst wordt de acylgroep van het substraat covalent verbonden aan het enzym, dit wordt het
acyl-enzyme intermediate genoemd.
- Het acyl-enzym tussenproduct wordt gehydrolyseerd waarbij een carboxyl zuurgroep en een
vrij enzym ontstaat. Deze tweede stap verloopt echter veel trager dan de eerste.
, De drie-dimensionale structuur van chymotrypsine toont aan dat het enzym ongeveer bolvormig is
en uit drie polypeptiden bestaat (gebonden door disulfide bindingen). Het eiwit is gesynthetiseerd als
chymotrypsinogen, deze wordt gekliefd waardoor de drie ketens ontstaan. De actieve site,
gemarkeerd met serine 195, ligt in een groeve aan het oppervlakte. De serine zijgroep wordt met
waterstofbruggen gebonden aan de ring van histidine 57. De NH groep van deze ring is gebonden aan
de carboxylaat groep van asparataan 102. Dit wordt de katalytische triade genoemd. Het histidine
residu zorgt ervoor dat de serine zijketen op de juiste positie ligt, daarnaast polaryseert het de
hydroxyl groep. In aanwezigheid van het substraat ontvangt het histidine residu een proton van het
serine 195 residu. Hierdoor ontstaat het alkoxide ion, dit is een veel sterkere nucleophile. Het
aspartaat residu zorgt voor het positioneren van histidine en maakt histidine een betere proton
acceptor door waterstofbruggen en elektrostatische effecten.
Na substraat binding gaat serine 195 een nucleophilische aanval aan op het carbonyl koolstof atoom
van de doelwit peptide binding. Hierdoor zijn er vier atomen verbonden aan het carbonyl atoom.
Hierdoor ontstaat het onstabiele tetrahedral intermediate. Hierdoor wordt het zuurstofatoom
negatief geleden, deze wordt gestabiliseerd door de NH groep van de oxanion hole. Het
tetrahedrische tussenproduct stort in waardoor het acyl-enzym gevormd wordt. Hierbij wordt een
proton van de positief geladen histidine groep overgedragen aan de aminogroep die ontstaat door de
klieving van de peptide binding. Het amine component laat het enzym nu los, waarna deze
geacytileerd achterblijft.
De deacetylatie begint als een water molecuul de plek inneemt van het amine substraat. Histidine
trekt nu een proton weg van het water molecuul. Hierdoor ontstaat er een OH - ion, deze valt het
carbonyl koolstof atoom van de acyl groep aan waardoor het tetrahedrische tussenproduct wordt
gevormd. Deze structuur breekt en vormt zo het carboxylzuur product. Als deze wordt losgelaten is
het enzym klaar voor de volgende katalyse.
Meer specifieke proteases hebben meer pockets voor de herkenning van meer residuen van het
substraat. Residuen aan de amino terminaal van de scissile bond (de binding die geklieft moet
worden) zijn gelabeld met P1, P2 …, met 1 het dichtste bij de binding. De residuen aan de craboxyl
zijde worden P1’, P2’ … genoemd. De bijbehorende plek op het enzym wordt S1, S1’ etc. genoemd.
Homologen van chymotrypsine:
Trypsine klieft aan de peptide binding van residuen met lange positief geladen zijketens (arginine en
lysine). Elastase knipt aan de peptide binding na residuen met korte zijketens (alanine en serine).
Verschillen in specifiteit tussen deze peptidasen wordt verklaard door structurele verschillen in de
pocket. Zo is aspartaat aanwezig in de pocket van trypsine wat positeif geladen zijktens bindt. Bij
elastase wordt de pocket deels geblokkeerd door grote zijketens van valanine.
Subtilisine is geen homoloog van chymotrypsine. Echter komt de active site sterk overeen door
convergente evolutie. Zo heeft de active site de katalytische triade en de oxyanion hole.
Daarnaast zijn er ook enkele proteases die een serine of threonine residu hebben die niet door
histidine maar door bijvoorbeeld lysine wordt geactiveerd.
De katalytische triade in proteases is dus drie keer onafhankelijk ontstaan in de evolutie.
Middels site directed mutagenesis kan gekeken worden naar de bijdrage aan de katalytische kracht
van specifieke residuen. Subtilisine is uitgebreid getest middels site directed mutagenesis. Zo is elke
aimozuur in de triade (aspartaan zuur, histidine en serine) vervangen door alanine. Vervolgens is het
functioneren van elk mutant enzym getest.
- De vervanging van serine heeft de katalytische kracht dramatisch verlaagd. De k cat verzwakte
met een miljoen keer, terwijl de KM redelijk stabiel bleef; het substraat kon dus wel normaal
binden.
- De mutatie van histidine gaf een vergelijkbaar resultaat.
