Inhoudsopgave p
Hoofdstuk 1. Basiseigenschappen biomoleculen 3
1.1 Nucleinezuren 3
Eiwitten 5
1.2 water als solvent 10
1.3 Effect zoutconcentratie op de oplosbaarheid van een eiwit in waterig milieu 18
1.4 Effect of organic solvents 20
1.5 Effect of pH 20
Hoofdstuk 2. Scheidingsmethoden 23
2.1 Centrifugation 23
2.1.1 Introduction 23
2.1.2 Preparative and analytical centrifugation 24
2.1.3 Basic principles of sedimentation 24
2.1.4 Centrifugation techniques 26
2.2 Chromatography 29
2.2.1 Introduction 29
2.2.2 Gel filtration 30
2.2.3 Ion-exchange chrmatography 32
2.2.4 Affinity chromatography 34
2.2.5 Reverse Phase Chromatography 35
2.2.6 High Performance Liquid Chromatography 36
2.2.7 Thin layer chrmaotography 37
2.3 Electrophoresis 39
2.3.1 Algemeen 39
2.3.2 Vormen van elcetrophorese 40
2.3.3 Polyacrylamide gelelectrophorese 41
2.3.4 Vormen van polyacrylamide electrophorese 43
2.3.5 Agarose electrophorese 45
2.4 Preparative and analytical applications of the separation technique 47
Hoofdstuk 3. Radiochemie 49
3.1 Inleiding 50
3.2 Gevoeligheid van radiochemische analyses 51
3.3 Efficientie van radioactiviteits meting 54
3.4 Isotopenverdunningsanalyse 54
3.5 Autoradiographie 54
3.6 Radio koolstof datering 57
Hoofdstuk 4. Immunochemie 59
4.1 Inleiding 59
4.2 Test op antilichaam vorming 59
4.3 Gebruik van antilichamen in kwantitatieve of semi-kwantitatieve analyses 62
4.4 Scintilatie proximity assay 67
4.5 Antilichamen als haptenen 68
,Hoofdstuk 5. Fluorescentiemethoden 69
5.1 Basis van fluorescentie 69
5.2 Fluorescentiemicroscopie 79
5.3 Fluorescente probes en hun toepassingen 89
Hoofdstuk 6. Recombinant DNA technologie & protein engineering 97
6.1 Introductie 97
6.2 DNA isolatie en manipulatie 98
6.3 Polymerase kettingreactie 100
6.4 Constructie van DNA bibliotheken 104
6.5 Screening van DNA bibliotheken 107
6.6 Productie van recombinant eiwitten 111
6.7 Gentherapie 116
6.8 Protein engineering 119
Hoofdstuk 7. Genomcis-gerelateerde technieken 127
7.1 Introductie en technologie 127
7.2 Sequencen van een genoom 128
7.3 Van genomic naar proteomics 129
7.4 Factoren die kunnen bijdragen aan de complexiteit van het proteoom 129
7.5 Technieken voor het meten van genexpressie op genoom-wijde schaal 130
7.6 RNA interference en systematische functionele analyse van het genoom 135
Hoofdstuk 8. Proteomics gerelateerde technieken 139
8.1 Introductie 139
8.2 Massaspectrometrie-gerelateerde proteomics 139
8.3 Protein microarrays 140
8.4 Activity-based protein profiling (ABPB) 143
8.5 Technieken voor het opsporen van eiwit-eiwit interacties in het proteoom 144
, Hoofdstuk 1. Basiseigenschappen van Biomoleculen
HOOFDSTUK 1. BASISEIGENSCHAPPEN VAN BIOMOLECULEN
1.1. INTRODUCTIE
Een mens bevat ongeveer 1014 cellen van wel meer dan 100 verschillende types.
Gespecialiseerde cellen vormen b.v. de huid, bindweefsel, zenuwweefsel, spierweefsel, bloed
etc. Elke cel bestaat voor ongeveer 70 % uit water en 25 % uit macromoleculen. Deze
macromuleculen kunnen we onderverdelen in:
• nucleïnezuren
• eiwitten
• polysacchariden
• lipiden
Nucleïnezuren
In de nucleïnezuren (deoxyribonucleïnezuur, DNA en ribonucleïnezuur, RNA) is de genetische
informatie opgeslagen of wordt de genetische informatie doorgegeven. Hierbij is de flow van
informatie als weergegeven in Fig. 1.1.
Figuur 1.1. Het centrale dogma in de moleculaire biologie.
De bouwstenen van het DNA zijn de deoxyribonucleotiden en van RNA zijn dat de
ribonucleotiden (Fig. 1.2).
Figuur 1.2. Bouwstenen van DNA (boven) en RNA (onder).
Al deze bouwstenen zijn door fosfodiesterbindingen met elkaar verbonden. Beperken we ons
daarbij tot DNA, dan ziet zo’n polymeer er als volgt uit (Fig. 1.3), waarbij de basen bestaan uit
Adenine, Cytosine, Guanine of Thymine.
3
, Hoofdstuk 1. Basiseigenschappen van Biomoleculen
Figuur 1.3. Deoxyribonucleïnezuur, DNA.
De pKa-waarden van de zure en basische groepen in een dergelijke polymeer staan vermeld in
Tabel 1.1.
Tabel 1.1. Ionisatiekonstantes van ribonucleotiden (aangegeven als pKa waarden).
Onder fysiologische condities (pH ongeveer 7.5) zijn de basen ongeladen (Fig. 1.4), met als
gevolg dat nucleïnezuren dan negatief geladen zijn vanwege de negatieve lading op de fosfaat
van de fosfodiesterbinding (pKa ~ 2).
4
Hoofdstuk 1. Basiseigenschappen biomoleculen 3
1.1 Nucleinezuren 3
Eiwitten 5
1.2 water als solvent 10
1.3 Effect zoutconcentratie op de oplosbaarheid van een eiwit in waterig milieu 18
1.4 Effect of organic solvents 20
1.5 Effect of pH 20
Hoofdstuk 2. Scheidingsmethoden 23
2.1 Centrifugation 23
2.1.1 Introduction 23
2.1.2 Preparative and analytical centrifugation 24
2.1.3 Basic principles of sedimentation 24
2.1.4 Centrifugation techniques 26
2.2 Chromatography 29
2.2.1 Introduction 29
2.2.2 Gel filtration 30
2.2.3 Ion-exchange chrmatography 32
2.2.4 Affinity chromatography 34
2.2.5 Reverse Phase Chromatography 35
2.2.6 High Performance Liquid Chromatography 36
2.2.7 Thin layer chrmaotography 37
2.3 Electrophoresis 39
2.3.1 Algemeen 39
2.3.2 Vormen van elcetrophorese 40
2.3.3 Polyacrylamide gelelectrophorese 41
2.3.4 Vormen van polyacrylamide electrophorese 43
2.3.5 Agarose electrophorese 45
2.4 Preparative and analytical applications of the separation technique 47
Hoofdstuk 3. Radiochemie 49
3.1 Inleiding 50
3.2 Gevoeligheid van radiochemische analyses 51
3.3 Efficientie van radioactiviteits meting 54
3.4 Isotopenverdunningsanalyse 54
3.5 Autoradiographie 54
3.6 Radio koolstof datering 57
Hoofdstuk 4. Immunochemie 59
4.1 Inleiding 59
4.2 Test op antilichaam vorming 59
4.3 Gebruik van antilichamen in kwantitatieve of semi-kwantitatieve analyses 62
4.4 Scintilatie proximity assay 67
4.5 Antilichamen als haptenen 68
,Hoofdstuk 5. Fluorescentiemethoden 69
5.1 Basis van fluorescentie 69
5.2 Fluorescentiemicroscopie 79
5.3 Fluorescente probes en hun toepassingen 89
Hoofdstuk 6. Recombinant DNA technologie & protein engineering 97
6.1 Introductie 97
6.2 DNA isolatie en manipulatie 98
6.3 Polymerase kettingreactie 100
6.4 Constructie van DNA bibliotheken 104
6.5 Screening van DNA bibliotheken 107
6.6 Productie van recombinant eiwitten 111
6.7 Gentherapie 116
6.8 Protein engineering 119
Hoofdstuk 7. Genomcis-gerelateerde technieken 127
7.1 Introductie en technologie 127
7.2 Sequencen van een genoom 128
7.3 Van genomic naar proteomics 129
7.4 Factoren die kunnen bijdragen aan de complexiteit van het proteoom 129
7.5 Technieken voor het meten van genexpressie op genoom-wijde schaal 130
7.6 RNA interference en systematische functionele analyse van het genoom 135
Hoofdstuk 8. Proteomics gerelateerde technieken 139
8.1 Introductie 139
8.2 Massaspectrometrie-gerelateerde proteomics 139
8.3 Protein microarrays 140
8.4 Activity-based protein profiling (ABPB) 143
8.5 Technieken voor het opsporen van eiwit-eiwit interacties in het proteoom 144
, Hoofdstuk 1. Basiseigenschappen van Biomoleculen
HOOFDSTUK 1. BASISEIGENSCHAPPEN VAN BIOMOLECULEN
1.1. INTRODUCTIE
Een mens bevat ongeveer 1014 cellen van wel meer dan 100 verschillende types.
Gespecialiseerde cellen vormen b.v. de huid, bindweefsel, zenuwweefsel, spierweefsel, bloed
etc. Elke cel bestaat voor ongeveer 70 % uit water en 25 % uit macromoleculen. Deze
macromuleculen kunnen we onderverdelen in:
• nucleïnezuren
• eiwitten
• polysacchariden
• lipiden
Nucleïnezuren
In de nucleïnezuren (deoxyribonucleïnezuur, DNA en ribonucleïnezuur, RNA) is de genetische
informatie opgeslagen of wordt de genetische informatie doorgegeven. Hierbij is de flow van
informatie als weergegeven in Fig. 1.1.
Figuur 1.1. Het centrale dogma in de moleculaire biologie.
De bouwstenen van het DNA zijn de deoxyribonucleotiden en van RNA zijn dat de
ribonucleotiden (Fig. 1.2).
Figuur 1.2. Bouwstenen van DNA (boven) en RNA (onder).
Al deze bouwstenen zijn door fosfodiesterbindingen met elkaar verbonden. Beperken we ons
daarbij tot DNA, dan ziet zo’n polymeer er als volgt uit (Fig. 1.3), waarbij de basen bestaan uit
Adenine, Cytosine, Guanine of Thymine.
3
, Hoofdstuk 1. Basiseigenschappen van Biomoleculen
Figuur 1.3. Deoxyribonucleïnezuur, DNA.
De pKa-waarden van de zure en basische groepen in een dergelijke polymeer staan vermeld in
Tabel 1.1.
Tabel 1.1. Ionisatiekonstantes van ribonucleotiden (aangegeven als pKa waarden).
Onder fysiologische condities (pH ongeveer 7.5) zijn de basen ongeladen (Fig. 1.4), met als
gevolg dat nucleïnezuren dan negatief geladen zijn vanwege de negatieve lading op de fosfaat
van de fosfodiesterbinding (pKa ~ 2).
4
