Samenvatting Biotechnologie

Biotechnologie
Methodes voor manipulatie van DNA
Genetische manipulatie (engineering) is het gebruik van in vitro technieken om genetische materiaal
in het laboratorium te veranderen. De genen die veranderd zijn kunnen teruggeplaatst worden in
origin van de host organisme. DNA moet in specifieke fragmenten geïsoleerd worden en opgezuiverd
worden voor verdere manipulatie.

Basistechnieken:
 Restrictie enzymen
 Gelelektroforese
 Nucleïnezuurhybridisatie
 Nucleïnezuursondes
 Moleculair klonen
 Klonen van vectoren

Restriction Enzymes and Nucleic Acid Separation
Restrictie enzymen herkennen specifieke DNA sequenties en knippen het DNA op deze plaatsen die
herkend worden. Bij het knippen worden de phosphodiester back bones geknipt. Het is essentieel
voor de in vitro DNA manipulatie, zeldzaam in eukaryoten, bescherm prokaryoten tegen vijandig
vreemd DNA (virale genomen).
Er zijn 3 verschillende klassen restrictie-enzymen:
 Type I; binden aan DNA bij de herkenninssequenties maar knippen het DNA op een bepaalde
afstand.
 Type II; splitsen DNA in herkenningssequentie en zijn het meest bruikbaar voor specifieke
DNA manipulatie.
 Type III; binden aan DNA bij de herkenninssequenties maar knippen het DNA op een
bepaalde afstand.

 Restrictie enzymen herkennen palindromen (omgekeerde herhalingssequenties). Het is
meestal 4-8 basenparen lang; EcoRI herkent een reeks van de 6 basenparen.
 Restrictie enzymen beschermen de cel tegen invasie door vreemd DNA. Het vernietigd
vreemd DNA. Het moet het eigen DNA beschermen tegen onbedoelde vernietiging.
 Sticky ends of blunt ends. De sticky ends worden gemaakt door EcoRI. Bij de sticky ends is als




er twee stukken uit elkaar gehaald worden en er twee verschillende dingen zijn. Het EcoRV
knipt beide strengen van het DNA direct tegenover elkaar, hier heb je niet zoveel aan (blunt
ends).

, Modificatie enzymen: beschermen het DNA van cellen voor restrictie enzymen. De modificatie
bestaat in het algemeen uit methylatie van DNA. Chemisch modificeren van nucleotiden in
restrictieherkenningssequentie. Het kan gemodificeerd worden met methylases, methylgroepen zijn
toegevoegd, bescherming restrictiesite van knippen door EcoRI en EcoRV.

Gelelektroforese: scheidt DNA moleculen op basis van grootte. Bij de elektroforese wordt gebruik
gemaakt van een elektrisch veld om geladen moleculen te scheiden. De gel is gemaakt van agarose,
een polysacharide. De nucleïnezuren migreren door gel naar de positieve elektrode vanwege de
negatief geladen fosfaatgroepen. De gel wordt gekleurd met ethidiumbromide en DNA kan worden
gevisualiseerd onder het UV licht. De kleine fragmenten lopen sneller door de gel dan de grote
fragmenten. Er is een spanningsverschil op het vel, de negatief gelanden DNA moleculen bewegen
naar de positieve pool toe.

The Polymerase Chain Reaction
DNA replicatie in vitro; amplificatie  PCR die de segmenten DNA kopieert.
1. Template DNA wordt gedenatureerd door de hitte.
2. Artificial DNA oligonucleitde primers worden op elke streng toegevoegd.
3. DNA polymerase extentie van primers gebruikmaken van originele DNA als template.
4. Incubatie tijd; temperatuur omhoog, streng gescheiden, target gen 2x zoveel aanwezig.
5. Temperatuur omlaag, primers hybridiseren met complementaire regio’s van nieuw gemaakt
DNA.




Toepassingen van PCR:
 Phylogenetic studies
 Het onderzoeken van verschillende groepen omgevingsorganismen (surveying different
groups of environmental organisms)
 Versterking van kleine hoeveelheden DNA (amplifying small amounts of DNA)
 Identificatie van een specifieke bacterie (identifying a specific bacteria)
 Op zoek naar een specifiek gen (looking for a specific gene)

Variaties van PCR:
 Reverse transcriptie PCR (RT-PCR); kan DNA van een RNA sjabloon maken, gebruikt het
enzym reverse transcriptase
 Kwantitatieve PCR (q-PCR); gebruikt een fluorescerende sonde om het versterkingsproces te
volgen