Gen- en celtechnologie
IN VITRO EN IN VIVO GENOME
EDITING DOOR CRISPR/CAS9
1. INLEIDING
Genome editing is een verzamelnaam van eender welke modificatie in het genoom van
een cel of organisme.
Voorbeelden: Het kan een disruptie zijn waarbij je de promotor kan gaan muteren om de
expressie te gaan aanpassen (knock-out model).
Het kan een insertie zijn van een reportergen na een bepaalde promotor om te weten
waar dat het gen zich bevindt.
Het kan een Single Nucleotide Polymorfisme (SNP) zijn die dan bijvoorbeeld zorgt voor
een puntmutatie.
Je kan LoxP-sites gaan invoegen om conditionele knock-outs te maken in vivo.
Het zijn allemaal endogene veranderingen van het DNA en geen exogene
toevoegingen.
Endonucleases zijn enzymes die het DNA gaan breken. Deze gaan eerst een double-
strand break gaan maken in het genoom, deze break moet dan gecorrigeerd worden. We
gaan gebruik maken van het feit dat die correctie eigenlijk niet correct gebeurt.
Er zijn twee manieren waarop je die double-strand breaks gaat repareren; de twee
repair-mechanisms.
i. Non-homologous end joining of NHEJ. Deze maakt foutjes waardoor je
random inserties of deleties krijgt op die plaats waar de ds break was. Deze
zijn heel simpel en hebben ook geen gebruik van templates nodig. Het werkt
zeer efficient, maar je weet niet zeker welk soort mutatie je uiteindelijk gaat
reproduceren. We spreken dan over error prone.
ii. Homology recombination of HR. Een template wordt mee binnen gebracht
met een endonuclease en dat gaat de homologe recombinatie specifiek iets
gaan veranderen op de site van het beschadigd DNA. Om zeker te weten welk
mutatie wordt gereproduceerd, gebruiken we deze techniek. Hierbij gaan we
een donortemplate gaan toevoegen aan het protocol en dit template zal
homoloog zijn aan zowel de linker- als rechterkant van de plaats waar de ds
break gebeurt. Je kan dan via recombinatie een echte insertie krijgen van het
gewenste mutatie in het genoom. Deze is dan iets minder efficient, maar je
weet wel exact waar je binnendringt.
1
,2. WAT IS CRISPR/CAS9?
Deze techniek gebruikt geen eiwitten om de endonuclease te gaan richten naar de juiste
plaats maar een RNA-oligonucleotide die homoloog is aan de regio waar dat je de
mutatie wilt. De RNA-guided systemen zijn veel gemakkelijker en efficiënter om toe te
passen, waardoor de zinc-fingers en TALENs-technieken volledig verdrongen zijn.
Het is een mechanisme gebruikt in de bacteriën en andere prokaryoten. Het is een soort
van immuniteitsmechanisme waarbij de bacteriën de faaggenomen kunnen gaan
aanvallen. Later werd een breakthrough ontdekt waarbij dit mechanisme kan gebruikt
worden in eukaryote cellen.
Het is een systeem dat kan gebruikt worden voor eender welk zoogdiercel op een heel
simpele manier. Het enige dat je nodig hebt is dat klein RNA-nucleotide die
homoloog is aan de site waar je de mutatie wilt en het Cas9-eiwit. De enige
bottleneck is dat je zowel dit RNA-nucleotide als de Cas9 samen moet binnenkrijgen in
de cel. De bottleneck is vooral de transsectie of de virale transductie van de cel, eens dat
dit lukt zal het bijna altijd lukken om via CRISPR/Cas een genoom te gaan modificeren.
Het systeem is ontdekt in bacteriën en wordt het gebruikt door bacteriën om zich te
beschermen tegen virussen. In deze cursus wordt enkel gesproken over de type II
CRISPR/Cas waarbij gebruik wordt gemaakt van het Cas9-eiwit. Deze creëren een
double-strand break in het DNA.
CRISPR/Cas: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-
Associated
2
, A. Hoe werkt het in een bacterie?
Figuur: tracrRNA. De bacterie heeft een tweede
RNA nodig namelijk de tracrRNA (=trans-
activating cr -RNA). Deze is homoloog aan een
stukje cr-RNA dat niet homoloog is aan de
target RNA. Die duplex van het tracr- en cr-
RNA zal het Cas-eiwit gaan aantrekken tot de
juiste plaats waar deze het target DNA kan
gaan verknippen.
Geel = spacer dat gestolen is geweest uit de
faag
Bij de type II CRISPR/Cas wordt er gebruik gemaakt van een Cas9-eiwit. Dit Cas9-
eiwit heeft een bepaalde sequentie-eiwit nodig genaamd de PAM-sequentie
(=Protospacer Adjacent Motif). De PAM-sequentie bevindt zich net downstream van de
protospacer, deze wordt herkend door 5’-NGG-3’ waarbij de N eender welke nucleotide
kan zijn.
B. Hoe werd CRISPR/Cas9 aangepast voor genome editing in het labo?
3
IN VITRO EN IN VIVO GENOME
EDITING DOOR CRISPR/CAS9
1. INLEIDING
Genome editing is een verzamelnaam van eender welke modificatie in het genoom van
een cel of organisme.
Voorbeelden: Het kan een disruptie zijn waarbij je de promotor kan gaan muteren om de
expressie te gaan aanpassen (knock-out model).
Het kan een insertie zijn van een reportergen na een bepaalde promotor om te weten
waar dat het gen zich bevindt.
Het kan een Single Nucleotide Polymorfisme (SNP) zijn die dan bijvoorbeeld zorgt voor
een puntmutatie.
Je kan LoxP-sites gaan invoegen om conditionele knock-outs te maken in vivo.
Het zijn allemaal endogene veranderingen van het DNA en geen exogene
toevoegingen.
Endonucleases zijn enzymes die het DNA gaan breken. Deze gaan eerst een double-
strand break gaan maken in het genoom, deze break moet dan gecorrigeerd worden. We
gaan gebruik maken van het feit dat die correctie eigenlijk niet correct gebeurt.
Er zijn twee manieren waarop je die double-strand breaks gaat repareren; de twee
repair-mechanisms.
i. Non-homologous end joining of NHEJ. Deze maakt foutjes waardoor je
random inserties of deleties krijgt op die plaats waar de ds break was. Deze
zijn heel simpel en hebben ook geen gebruik van templates nodig. Het werkt
zeer efficient, maar je weet niet zeker welk soort mutatie je uiteindelijk gaat
reproduceren. We spreken dan over error prone.
ii. Homology recombination of HR. Een template wordt mee binnen gebracht
met een endonuclease en dat gaat de homologe recombinatie specifiek iets
gaan veranderen op de site van het beschadigd DNA. Om zeker te weten welk
mutatie wordt gereproduceerd, gebruiken we deze techniek. Hierbij gaan we
een donortemplate gaan toevoegen aan het protocol en dit template zal
homoloog zijn aan zowel de linker- als rechterkant van de plaats waar de ds
break gebeurt. Je kan dan via recombinatie een echte insertie krijgen van het
gewenste mutatie in het genoom. Deze is dan iets minder efficient, maar je
weet wel exact waar je binnendringt.
1
,2. WAT IS CRISPR/CAS9?
Deze techniek gebruikt geen eiwitten om de endonuclease te gaan richten naar de juiste
plaats maar een RNA-oligonucleotide die homoloog is aan de regio waar dat je de
mutatie wilt. De RNA-guided systemen zijn veel gemakkelijker en efficiënter om toe te
passen, waardoor de zinc-fingers en TALENs-technieken volledig verdrongen zijn.
Het is een mechanisme gebruikt in de bacteriën en andere prokaryoten. Het is een soort
van immuniteitsmechanisme waarbij de bacteriën de faaggenomen kunnen gaan
aanvallen. Later werd een breakthrough ontdekt waarbij dit mechanisme kan gebruikt
worden in eukaryote cellen.
Het is een systeem dat kan gebruikt worden voor eender welk zoogdiercel op een heel
simpele manier. Het enige dat je nodig hebt is dat klein RNA-nucleotide die
homoloog is aan de site waar je de mutatie wilt en het Cas9-eiwit. De enige
bottleneck is dat je zowel dit RNA-nucleotide als de Cas9 samen moet binnenkrijgen in
de cel. De bottleneck is vooral de transsectie of de virale transductie van de cel, eens dat
dit lukt zal het bijna altijd lukken om via CRISPR/Cas een genoom te gaan modificeren.
Het systeem is ontdekt in bacteriën en wordt het gebruikt door bacteriën om zich te
beschermen tegen virussen. In deze cursus wordt enkel gesproken over de type II
CRISPR/Cas waarbij gebruik wordt gemaakt van het Cas9-eiwit. Deze creëren een
double-strand break in het DNA.
CRISPR/Cas: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-
Associated
2
, A. Hoe werkt het in een bacterie?
Figuur: tracrRNA. De bacterie heeft een tweede
RNA nodig namelijk de tracrRNA (=trans-
activating cr -RNA). Deze is homoloog aan een
stukje cr-RNA dat niet homoloog is aan de
target RNA. Die duplex van het tracr- en cr-
RNA zal het Cas-eiwit gaan aantrekken tot de
juiste plaats waar deze het target DNA kan
gaan verknippen.
Geel = spacer dat gestolen is geweest uit de
faag
Bij de type II CRISPR/Cas wordt er gebruik gemaakt van een Cas9-eiwit. Dit Cas9-
eiwit heeft een bepaalde sequentie-eiwit nodig genaamd de PAM-sequentie
(=Protospacer Adjacent Motif). De PAM-sequentie bevindt zich net downstream van de
protospacer, deze wordt herkend door 5’-NGG-3’ waarbij de N eender welke nucleotide
kan zijn.
B. Hoe werd CRISPR/Cas9 aangepast voor genome editing in het labo?
3
