MOLECULEN: EIWITTEN EN ENZYMEN – HOORCOLLEGES
H1&2: ANALYSETECHNIEKEN
• Proteoom: alle eiwitten die in de cel/het organisme aanwezig zijn
-> Humaan proteoom: ong. 47.000 eiwitten is gebaseerd op primaire structuur
Daarnaast ook nog post-translationele modifcaties: 200.000-2.000.000 verschillende eiwitten
• Vergelijk: Genoom: alle gentische informatie van de cel/het organisme. Deze informatie wordt
niet in elke cel afgelezen
Eiwitten onderzoeken
• Analytisch: bekijken
- Kwalitatief: welk eiwit is aanwezig
- Kwantitatief: hoeveel van het eiwit is aanwezig
• Preparatief: hebben/in handen krijgen
- Opzuiveren van actief eiwit uit cel/weefsel/organisme
• Detectie: in beide gevallen moet je een specifieke test hebben voor het eiwit dat je bestudeert
Analytische methoden
Gel-elektroforese
• v = (E x z) / f
v = snelheid; E = sterkte elektrische; z = lading eiwit; f = wrijvingscoëfficiënt
• Het dragermateriaal van de gel is polyacrylamide
- functioneert als een moleculaire zeef
- chemische inert
- gemakkelijk te maken
- poriëngrootte te variëren: % acrylamide en % cross-linker: (methylene) bisacrylamide
• Scheiding op lading én vorm/grootte
SDS-PAGE
• SDS denatureert eiwitten (ontvouwen, alle eiwitten ongeveer dezelfde vorm) en maakt eiwitten
uniform negatief.
• De verhouding tussen lading en massa voor alle eiwitten zijn nagenoeg hetzelfde, dus alleen
scheiding op grootte van de eiwitten en niet de lading. Het loopgedrag is ongeveer gelijk aan log
(molmassa)
• Per 1 molecuul SDS kunnen 2 aminozuren binden: lading per massa voor alle eiwitten is
nagenoeg hetzelfde
• Beta-mercatoethanol of DDT wordt bijna altijd gebruikt om zwavelbruggen te reduceren
• Eiwitten met SDS die negatief geladen zijn, bewegen naar de + pool
• De porie-grootte is aan te passen aan de gewenste scheiding
• Eiwitten kunnen worden aangekleurd met een kleurstof (bijv. Simply Blue, Coomassie Briljant
Blue)
• Een molecular weight marker kan worden gebruikt om het verband tussen Log (MW) en
migratie-afstand te schatten
Iso-electric focussing (IEF)
• Polyacrylamide gel met pH-gradient (ampholyten-oplossing)
• Op het iso-elektrisch punt van het eiwit is de netto lading nul:
wordt net zo hard naar + als naar – pool getrokken
,• Eerst worden de eiwitten gescheiden op lading (iso-electric focussing) en daarna wordt SDS-
page uitgevoerd, dus scheiden op grootte van het eiwit. Je scheidt eiwitten in twee dimensies.
• 2D elektroforese: van elke stip weet je nu molmassa en iso-elektrisch punt; je kan meer dan 1000
eiwitten zichtbaar maken
Preparatieve technieken
Opzuiveren van specifieke eiwitten
Eiwitten worden van elkaar gescheiden op basis van:
• Grootte (bv. gelfiltratie chromatografie)
• Oplosbaarheid (bv. ammoniumsulfaat precipitatie)
• Lading (bv. ionenwisselaar chromatografie)
• Bindingsaffiniteit (affiniteitszuivering), etc.
→ Het doel (bij zuivering van enzymen) is om een zo hoog mogelijke activiteit te krijgen, in een
oplossing met zo min mogelijk verschillende eiwitten. Wat je daarvoor moet doen is voor ieder
enzym ander, en is een vak apart.
Dialyse
Methode om opgeloste eiwitten te scheiden van veel kleinere moleculen in oplossing, Hiervoor
gebruik je een dialyse: membraan. Principe: semi-permeabele membraan laat alleen heel kleine
moleculen (bv. ionen, aminozuren, etc.) door en (grote) eiwitten niet. Geen scheiding tussen kleine
en grote eiwitten. Door het vaker uit tevoren achter elkaar, kan je beter scheiden.
Gel-filtratie
Scheiding van eiwitten op basis van grootte. Kleinere eiwitten passen gemakkelijker in de gaten in
poreuze gel-bolletjes. Grootte eiwit bepaalt afgelegde weg: klein eiwit = lange weg. Grootste eiwitten
komen als eerste uit de kolom.
,Ionenwisselaar
• Eiwitten met een bepaalde lading binden aan geladen gel-bolletjes. De lading van het eiwit
bepaalt de bindingssterkte. Met een zoutgradiënt is de binding te verbreken: elutie.
• Buffer zorgt ervoor dat zoutsterkte en pH goed blijven; Door een juiste buffer te kiezen, binden
sommige eiwitten wel en andere niet
• Anionenwisselaar bindt aan anionen (negatief geladen ion), dus zelf positief
• Kationenwisselaar bindt aan kationen (positief geladen ion), dus zelf negatief
Apparatuur voor ionenwisselaar chromtografie:
- HPLC: high pressure liquid chromatografie
- FPLC: fast protein liquid chromatografie
- ‘gewone’ kolomchromatografie
(Ultra) centrifugatie
Scheiding van eiwitten op basis van de mate van sedimentatie (zinken). De sedimentcoëfficiënt
(bezinkingssnelheid) is afhankelijk van:
• Massa van het deeltje
• Vorm van het deeltje
• Dichtheid van de oplossing
• Dichtheid van het deeltje
Celfractionering mbv Ultracentrifugatie
• Homogenaat maakt cellen kapot
• Lysaat kan activiteit verminderen (zeep
gebruiken)
, Eiwitzuivering mbv gradientcentrifugatie
Antilichamen
• Antilichamen zijn tools voor zuivering en detectie van eiwitten
• Antilichamen zijn te kweken door een stukje eiwit in te spuiten in een dier. Vervolgens geeft het
dier een immuunrespons op dit stukje eiwit, waardoor antlichamen ontstaan tegen dit eiwit.
Vervolgens zuiver je de antilichamen op.
• Primair antilichaam: herkent specifiek eiwit
• Secundair antilichaam: herkent primaire antilichaam uit specifiek dier, bv. geit-anti-konijn
• Voordelen:
- Je hoeft alleen het secundaire antilichaam te koppelen aan de detectie-groep om alle primaire
antilichamen uit 1 diersoort te kunnen detecteren
- Er kunnen twee secundaire antilichamen aan één primair antlichaam binden
(signaalversterking)
• Herkennen heel specifiek antigen
- antigen is bv. een eiwit
- epitoop is het deel van het eiwit dat herkend wordt
• Polyclonaal antilichaam: mix van antilichamen die meerdere epitopen (van hetzelfde antigen)
herkennen → meerdere epitopen op hetzelfde antigen
Vb. Bij een immuunrespons produceert het lichaam meerdere antilichamen tegen zelfde antigen:
ze komen uit meerdere clones van B-cellen
• Monoclonaal antlichaam: zuiver antilichaam dat slechts 1 epitoop herkent → één epitoop op
één antigen
• Monoclonaal heeft minder achtergrond, maar polyclonaal kan vaak zelfde antigen (eiwit) in
meerdere isoformen herkennen
• Antilichamen hebben een zeer sterke, specifieke binding
H1&2: ANALYSETECHNIEKEN
• Proteoom: alle eiwitten die in de cel/het organisme aanwezig zijn
-> Humaan proteoom: ong. 47.000 eiwitten is gebaseerd op primaire structuur
Daarnaast ook nog post-translationele modifcaties: 200.000-2.000.000 verschillende eiwitten
• Vergelijk: Genoom: alle gentische informatie van de cel/het organisme. Deze informatie wordt
niet in elke cel afgelezen
Eiwitten onderzoeken
• Analytisch: bekijken
- Kwalitatief: welk eiwit is aanwezig
- Kwantitatief: hoeveel van het eiwit is aanwezig
• Preparatief: hebben/in handen krijgen
- Opzuiveren van actief eiwit uit cel/weefsel/organisme
• Detectie: in beide gevallen moet je een specifieke test hebben voor het eiwit dat je bestudeert
Analytische methoden
Gel-elektroforese
• v = (E x z) / f
v = snelheid; E = sterkte elektrische; z = lading eiwit; f = wrijvingscoëfficiënt
• Het dragermateriaal van de gel is polyacrylamide
- functioneert als een moleculaire zeef
- chemische inert
- gemakkelijk te maken
- poriëngrootte te variëren: % acrylamide en % cross-linker: (methylene) bisacrylamide
• Scheiding op lading én vorm/grootte
SDS-PAGE
• SDS denatureert eiwitten (ontvouwen, alle eiwitten ongeveer dezelfde vorm) en maakt eiwitten
uniform negatief.
• De verhouding tussen lading en massa voor alle eiwitten zijn nagenoeg hetzelfde, dus alleen
scheiding op grootte van de eiwitten en niet de lading. Het loopgedrag is ongeveer gelijk aan log
(molmassa)
• Per 1 molecuul SDS kunnen 2 aminozuren binden: lading per massa voor alle eiwitten is
nagenoeg hetzelfde
• Beta-mercatoethanol of DDT wordt bijna altijd gebruikt om zwavelbruggen te reduceren
• Eiwitten met SDS die negatief geladen zijn, bewegen naar de + pool
• De porie-grootte is aan te passen aan de gewenste scheiding
• Eiwitten kunnen worden aangekleurd met een kleurstof (bijv. Simply Blue, Coomassie Briljant
Blue)
• Een molecular weight marker kan worden gebruikt om het verband tussen Log (MW) en
migratie-afstand te schatten
Iso-electric focussing (IEF)
• Polyacrylamide gel met pH-gradient (ampholyten-oplossing)
• Op het iso-elektrisch punt van het eiwit is de netto lading nul:
wordt net zo hard naar + als naar – pool getrokken
,• Eerst worden de eiwitten gescheiden op lading (iso-electric focussing) en daarna wordt SDS-
page uitgevoerd, dus scheiden op grootte van het eiwit. Je scheidt eiwitten in twee dimensies.
• 2D elektroforese: van elke stip weet je nu molmassa en iso-elektrisch punt; je kan meer dan 1000
eiwitten zichtbaar maken
Preparatieve technieken
Opzuiveren van specifieke eiwitten
Eiwitten worden van elkaar gescheiden op basis van:
• Grootte (bv. gelfiltratie chromatografie)
• Oplosbaarheid (bv. ammoniumsulfaat precipitatie)
• Lading (bv. ionenwisselaar chromatografie)
• Bindingsaffiniteit (affiniteitszuivering), etc.
→ Het doel (bij zuivering van enzymen) is om een zo hoog mogelijke activiteit te krijgen, in een
oplossing met zo min mogelijk verschillende eiwitten. Wat je daarvoor moet doen is voor ieder
enzym ander, en is een vak apart.
Dialyse
Methode om opgeloste eiwitten te scheiden van veel kleinere moleculen in oplossing, Hiervoor
gebruik je een dialyse: membraan. Principe: semi-permeabele membraan laat alleen heel kleine
moleculen (bv. ionen, aminozuren, etc.) door en (grote) eiwitten niet. Geen scheiding tussen kleine
en grote eiwitten. Door het vaker uit tevoren achter elkaar, kan je beter scheiden.
Gel-filtratie
Scheiding van eiwitten op basis van grootte. Kleinere eiwitten passen gemakkelijker in de gaten in
poreuze gel-bolletjes. Grootte eiwit bepaalt afgelegde weg: klein eiwit = lange weg. Grootste eiwitten
komen als eerste uit de kolom.
,Ionenwisselaar
• Eiwitten met een bepaalde lading binden aan geladen gel-bolletjes. De lading van het eiwit
bepaalt de bindingssterkte. Met een zoutgradiënt is de binding te verbreken: elutie.
• Buffer zorgt ervoor dat zoutsterkte en pH goed blijven; Door een juiste buffer te kiezen, binden
sommige eiwitten wel en andere niet
• Anionenwisselaar bindt aan anionen (negatief geladen ion), dus zelf positief
• Kationenwisselaar bindt aan kationen (positief geladen ion), dus zelf negatief
Apparatuur voor ionenwisselaar chromtografie:
- HPLC: high pressure liquid chromatografie
- FPLC: fast protein liquid chromatografie
- ‘gewone’ kolomchromatografie
(Ultra) centrifugatie
Scheiding van eiwitten op basis van de mate van sedimentatie (zinken). De sedimentcoëfficiënt
(bezinkingssnelheid) is afhankelijk van:
• Massa van het deeltje
• Vorm van het deeltje
• Dichtheid van de oplossing
• Dichtheid van het deeltje
Celfractionering mbv Ultracentrifugatie
• Homogenaat maakt cellen kapot
• Lysaat kan activiteit verminderen (zeep
gebruiken)
, Eiwitzuivering mbv gradientcentrifugatie
Antilichamen
• Antilichamen zijn tools voor zuivering en detectie van eiwitten
• Antilichamen zijn te kweken door een stukje eiwit in te spuiten in een dier. Vervolgens geeft het
dier een immuunrespons op dit stukje eiwit, waardoor antlichamen ontstaan tegen dit eiwit.
Vervolgens zuiver je de antilichamen op.
• Primair antilichaam: herkent specifiek eiwit
• Secundair antilichaam: herkent primaire antilichaam uit specifiek dier, bv. geit-anti-konijn
• Voordelen:
- Je hoeft alleen het secundaire antilichaam te koppelen aan de detectie-groep om alle primaire
antilichamen uit 1 diersoort te kunnen detecteren
- Er kunnen twee secundaire antilichamen aan één primair antlichaam binden
(signaalversterking)
• Herkennen heel specifiek antigen
- antigen is bv. een eiwit
- epitoop is het deel van het eiwit dat herkend wordt
• Polyclonaal antilichaam: mix van antilichamen die meerdere epitopen (van hetzelfde antigen)
herkennen → meerdere epitopen op hetzelfde antigen
Vb. Bij een immuunrespons produceert het lichaam meerdere antilichamen tegen zelfde antigen:
ze komen uit meerdere clones van B-cellen
• Monoclonaal antlichaam: zuiver antilichaam dat slechts 1 epitoop herkent → één epitoop op
één antigen
• Monoclonaal heeft minder achtergrond, maar polyclonaal kan vaak zelfde antigen (eiwit) in
meerdere isoformen herkennen
• Antilichamen hebben een zeer sterke, specifieke binding
