Moleculaire microbiologie Les 1 & 2: Amplifcaaie
aechnieken van de deaecaie van micro-organismen
Moleculaire technieken – mijlpalen
- James Watson en Francis Crick (1953): ontrafeling dubbele helix structuur
- Fred Sanger: ontwikkeling efciënte sequence methodiek
- Kary Mullis: uitvinding Polymerase Chain Reacton
- Roche: Eerste commerciële moleculaire tests
Bacterie identicate
Hiervoor kijken we naar de morfologie (bouw en vorm), de bacterie kleuring, de groei op
kweekmedia onder verschillende laboratorium condites en het fenotypering o.b.v.
biologische kenmerken.
Heeft kennis en begriik van syntheesen en stricttccri van
nctleinezcrien
DNA heef een lange dubbele helix met suiker (deoxyribose)
+ een fosfaat buitenstructuur en basen aan de binnenzijde.
De helix wordt gestabiliseerd door waterstofruggen.
DNA kent 4 base adenine (A) wat altjd bindt aan een
thymine (T) met twee waterstofruggen en guanine (G) wat
altjd bindt aan cytosine (C) met drie waterstofruggen.
RNA heef ribose ipv deoxyribose, uracil (U) ipv thymine en
heef maar 1 streng in plaats van
Transcripte: hierbij wordt DNA gekopieerd tot mRNA
Translate: hierbij wordt dit RNA afgelezen en wordt er een complementaire streng gevormd
Herikent sense en antisense seqcentes
Sense streng is de streng van DNA die niet gebruikt wordt als een sjabloon in het
transcripteproces. Maar het resulterende RNA-molecuul is exact identek aan de sense
treng, behalve de aanwezigheid van uracil in plaats van thymine. De sense strand bevat
codons. De Antsense strand is de template strand die gebuikt wordt bij het
transcripteproces. De resulterende mRNA en sense streng zijn complementair aan deze
streng. Deze streng bevat ant-codons.
Begriijkt heet kriintike van rieal tie PR
Real tme PCR is een techniek voor het ampliiceren van DNA waarbij de hoeveelheid
geampliiceerd DNA tussentjds wordt bijgehouden ipv achteraf zoals bij de gewone PCR.
Voor het gebruik van de PCR detecte van speciieke sequentes zijn minimaal 3 verschillende
laboratoriumruimtes nodig
1. De schone ruimte: deze heef overdruk, de lucht stroomt naar buiten want deze ruimte
moet schoon blijven
. Hier bewaar je je DNA samples en interne controle (vriezer of koelkast). Met de interne
controle controleer je een remming, als die geen positef signaal geef dan is je waarde niet
,betrouwbaar. In deze ruimte heerst een onderdruk. De lucht stroomt naar binnen want de
bacteriën mogen niet naar buiten.
3. PCR
4. Deze ruimte gebruiken we eigenlijk niet. Deze is voor het runnen van de gel, hier mogen
de epjes wel weer open.
Kan de veristheillende toikonenten van een PRiiix benoeien
Essentële ingrediënten van PCR mix:
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle dNTP’s: 0- 00 micromolair van alle 4 de dNTP’s. Een te hoge concentrate kan
synthesefouten veroorzaken
- PCR-buffer: Tris-HCL buffer van pH = 7,8 is optmaal. Optoneel van Tween
(stabiliseert Taq), BSA, eenwaardige ionen.
- Taq-DNA polymerase
- MgCl , essentële cofactor voor Taq- en heef stabiliserend effect
- Primers
Gewoon DNA-polymerase heef een proofreading (3’-5’ actviteit) Taq-DNA-polymerase doet
dit niet, als je gaat sequencen is het dus niet verstandig om TAQ te gebruiken.
Kent de vooriwaariden waari een kriiieri/kriobe aan ioet voldoen
Een goede primer moet zich aan de volgende eisen voldoen:
- Ongeveer tussen de 18- 5 nucleotden lang
- Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC-gehalte (40-70%)
- Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
- Geen baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen de twee
primers (primer-dimeer)
- Amplicon b.v.k. 75- 00 bp. Hoogste efciënte
- Smeltemperatuur tussen ca 50 en 65 graden Celsius
Bij het kiezen van een gen kan je kiezen tussen variabel en
conservatef, en tussen universeel en speciiek.
We kennen de volgende real tme PCR-varianten
- SYBR-green bindt dsDNA
- TaqMan maakt gebruik van een probe
Eigenschappen van de probe:
- Probe moet eerder op DNA dan de primers (Tm tussen 60 en 70 graden Celsius)
- GC-gehalte tussen 0-80%
- Geen lange herhalingen van nucleotden (GGGG)
- Geen G’s aan 5’-kant
- Meer C’s dan G’s
Real tme PCR is de mogelijkheid om PCR-producten te monitoren of visualiseren
gebruikmakende van fuorescente. Een voordeel van realtme PCR is dat je geen gel meer
hoef te maken (geen vervuiling van het lab).
, Voordelen Real tme PCR
- Snelle verwerking: cycling tmes is gelijk aan of kleiner dan 1,5 uur
- Hoge sampling throughput (rond de 00 monsters per dag)
- Gevoelig (detecteert kleinere verschillen tussen samples)
- Grote dynamische range (10-1010 copies)
- Reproduceerbaar (CV < ,0%)
- Laag contaminaterisico (gesloten systeem)
- Flexibele proefopzet (want SYBR green kan heel veel verschillende pathogenen
aantonen
- Multplex mogelijk (meerdere targets)
- Sofware gestuurd
Real tme PCR nadelen
- Niet ideaal voor multplexing (maar wel mogelijk)
- Set up: vereiste aan technische vaardigheden en kennis
- Investering apparatuur
- Intra- en interassay variate
- RNA labiel
- DNA-contaminate (bij mRNA analyse)
Threshold: de scheiding van speciieke metngen en wanneer je eigenlijk nog ruis aan het
meten bent
Ct waarde: de waarde waarbij hij voor het eerst boven die ruis uitkomt. Mbv deze Ct waarde
kan je terugrekenen waar je startwaarde was
We kennen 3 methoden om de test te kwanticeren
1. DNA-bindende stoffen (SYBR Green, EvaGreen, LC Green)
. Hydrolyserende probes (TaqMan, Beacons)
3. Hybridiserende of FRET probes
Begriijkt heet kriintike van DNA bindende stofen
Een voorbeeld van een DNA bindende stof is SYBR Green. Deze stof bindt aan dubbelstrengs
DNA waarna het complex blauw licht absorbeert en groen licht uitstraalt. Het wordt gebruikt
bij real tme PCR omdat de fuorescente gemeten kan worden aan het einde van elke cycli
zodat er kan worden gekeken hoeveel DNA er is geampliiceerd.
aechnieken van de deaecaie van micro-organismen
Moleculaire technieken – mijlpalen
- James Watson en Francis Crick (1953): ontrafeling dubbele helix structuur
- Fred Sanger: ontwikkeling efciënte sequence methodiek
- Kary Mullis: uitvinding Polymerase Chain Reacton
- Roche: Eerste commerciële moleculaire tests
Bacterie identicate
Hiervoor kijken we naar de morfologie (bouw en vorm), de bacterie kleuring, de groei op
kweekmedia onder verschillende laboratorium condites en het fenotypering o.b.v.
biologische kenmerken.
Heeft kennis en begriik van syntheesen en stricttccri van
nctleinezcrien
DNA heef een lange dubbele helix met suiker (deoxyribose)
+ een fosfaat buitenstructuur en basen aan de binnenzijde.
De helix wordt gestabiliseerd door waterstofruggen.
DNA kent 4 base adenine (A) wat altjd bindt aan een
thymine (T) met twee waterstofruggen en guanine (G) wat
altjd bindt aan cytosine (C) met drie waterstofruggen.
RNA heef ribose ipv deoxyribose, uracil (U) ipv thymine en
heef maar 1 streng in plaats van
Transcripte: hierbij wordt DNA gekopieerd tot mRNA
Translate: hierbij wordt dit RNA afgelezen en wordt er een complementaire streng gevormd
Herikent sense en antisense seqcentes
Sense streng is de streng van DNA die niet gebruikt wordt als een sjabloon in het
transcripteproces. Maar het resulterende RNA-molecuul is exact identek aan de sense
treng, behalve de aanwezigheid van uracil in plaats van thymine. De sense strand bevat
codons. De Antsense strand is de template strand die gebuikt wordt bij het
transcripteproces. De resulterende mRNA en sense streng zijn complementair aan deze
streng. Deze streng bevat ant-codons.
Begriijkt heet kriintike van rieal tie PR
Real tme PCR is een techniek voor het ampliiceren van DNA waarbij de hoeveelheid
geampliiceerd DNA tussentjds wordt bijgehouden ipv achteraf zoals bij de gewone PCR.
Voor het gebruik van de PCR detecte van speciieke sequentes zijn minimaal 3 verschillende
laboratoriumruimtes nodig
1. De schone ruimte: deze heef overdruk, de lucht stroomt naar buiten want deze ruimte
moet schoon blijven
. Hier bewaar je je DNA samples en interne controle (vriezer of koelkast). Met de interne
controle controleer je een remming, als die geen positef signaal geef dan is je waarde niet
,betrouwbaar. In deze ruimte heerst een onderdruk. De lucht stroomt naar binnen want de
bacteriën mogen niet naar buiten.
3. PCR
4. Deze ruimte gebruiken we eigenlijk niet. Deze is voor het runnen van de gel, hier mogen
de epjes wel weer open.
Kan de veristheillende toikonenten van een PRiiix benoeien
Essentële ingrediënten van PCR mix:
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle dNTP’s: 0- 00 micromolair van alle 4 de dNTP’s. Een te hoge concentrate kan
synthesefouten veroorzaken
- PCR-buffer: Tris-HCL buffer van pH = 7,8 is optmaal. Optoneel van Tween
(stabiliseert Taq), BSA, eenwaardige ionen.
- Taq-DNA polymerase
- MgCl , essentële cofactor voor Taq- en heef stabiliserend effect
- Primers
Gewoon DNA-polymerase heef een proofreading (3’-5’ actviteit) Taq-DNA-polymerase doet
dit niet, als je gaat sequencen is het dus niet verstandig om TAQ te gebruiken.
Kent de vooriwaariden waari een kriiieri/kriobe aan ioet voldoen
Een goede primer moet zich aan de volgende eisen voldoen:
- Ongeveer tussen de 18- 5 nucleotden lang
- Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC-gehalte (40-70%)
- Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
- Geen baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen de twee
primers (primer-dimeer)
- Amplicon b.v.k. 75- 00 bp. Hoogste efciënte
- Smeltemperatuur tussen ca 50 en 65 graden Celsius
Bij het kiezen van een gen kan je kiezen tussen variabel en
conservatef, en tussen universeel en speciiek.
We kennen de volgende real tme PCR-varianten
- SYBR-green bindt dsDNA
- TaqMan maakt gebruik van een probe
Eigenschappen van de probe:
- Probe moet eerder op DNA dan de primers (Tm tussen 60 en 70 graden Celsius)
- GC-gehalte tussen 0-80%
- Geen lange herhalingen van nucleotden (GGGG)
- Geen G’s aan 5’-kant
- Meer C’s dan G’s
Real tme PCR is de mogelijkheid om PCR-producten te monitoren of visualiseren
gebruikmakende van fuorescente. Een voordeel van realtme PCR is dat je geen gel meer
hoef te maken (geen vervuiling van het lab).
, Voordelen Real tme PCR
- Snelle verwerking: cycling tmes is gelijk aan of kleiner dan 1,5 uur
- Hoge sampling throughput (rond de 00 monsters per dag)
- Gevoelig (detecteert kleinere verschillen tussen samples)
- Grote dynamische range (10-1010 copies)
- Reproduceerbaar (CV < ,0%)
- Laag contaminaterisico (gesloten systeem)
- Flexibele proefopzet (want SYBR green kan heel veel verschillende pathogenen
aantonen
- Multplex mogelijk (meerdere targets)
- Sofware gestuurd
Real tme PCR nadelen
- Niet ideaal voor multplexing (maar wel mogelijk)
- Set up: vereiste aan technische vaardigheden en kennis
- Investering apparatuur
- Intra- en interassay variate
- RNA labiel
- DNA-contaminate (bij mRNA analyse)
Threshold: de scheiding van speciieke metngen en wanneer je eigenlijk nog ruis aan het
meten bent
Ct waarde: de waarde waarbij hij voor het eerst boven die ruis uitkomt. Mbv deze Ct waarde
kan je terugrekenen waar je startwaarde was
We kennen 3 methoden om de test te kwanticeren
1. DNA-bindende stoffen (SYBR Green, EvaGreen, LC Green)
. Hydrolyserende probes (TaqMan, Beacons)
3. Hybridiserende of FRET probes
Begriijkt heet kriintike van DNA bindende stofen
Een voorbeeld van een DNA bindende stof is SYBR Green. Deze stof bindt aan dubbelstrengs
DNA waarna het complex blauw licht absorbeert en groen licht uitstraalt. Het wordt gebruikt
bij real tme PCR omdat de fuorescente gemeten kan worden aan het einde van elke cycli
zodat er kan worden gekeken hoeveel DNA er is geampliiceerd.
