GESLAAGD IN 1e ZIT (18/20). Samenvatting inleiding tot biotechnologie en genetica

Inleiding tot biotechnologie & genetica




Inhoudsopgave
1 Inleiding: biotechnologie ........................................................................................... 3
2 Basisbegrippen/technieken in biotechnologie & genetica ........................................... 7
2.1 DNA-RNA ..................................................................................................................... 7
2.1.1 dna-structuur .................................................................................................................................. 7
2.1.2 denaturatie – renaturatie ................................................................................................................ 8
2.1.3 DNA-replicatie ............................................................................................................................... 11
2.2 De “polymerase chain reaction”: PCR .......................................................................... 15
2.2.1 principe van de pcr-reactie ............................................................................................................ 15
2.2.2 chemische synthese van dna ......................................................................................................... 18
2.2.3 uitvoering van de pcr reactie ......................................................................................................... 23
2.2.4 Taq polymerase ............................................................................................................................. 26
2.2.5 oorsprong van dna voor de PCR reactie ........................................................................................ 27
2.2.6 gebruik pcr (toepassingen) ............................................................................................................ 27
2.3 DNA mutaties en herstelmechanismen........................................................................ 39
2.3.1 DNA mutaties ................................................................................................................................ 39
2.3.2 herstelmechanismen ..................................................................................................................... 43
2.4 DNA sequenering ....................................................................................................... 46
2.4.1 SAnger sequencing ........................................................................................................................ 46
2.4.2 cycle-sequencing ........................................................................................................................... 49
2.4.3 NGS – next generation sequencing ............................................................................................... 52
2.5 Restrictie enzymen (RE) .............................................................................................. 53
2.5.1 DNA ligase ..................................................................................................................................... 54
2.5.2 restrictiemappen ........................................................................................................................... 55
2.6 Isolatie van een gen .................................................................................................... 56
2.6.1 belangrijkste methode (isolatie gen) ............................................................................................. 56
2.6.2 alternatief: synthetisch aanmaken ................................................................................................ 58
2.6.3 geïsoleerd mrna  cdna ............................................................................................................... 59
2.6.4 cdna in plasmide brengen ............................................................................................................. 60
2.6.5 reverse trancriptase gelinkt aan polymerase chain reactie (RT-PCR) ............................................ 64

3 De eukaryote celkern ............................................................................................... 67
3.1 De eukaryote cel en haar celkern ................................................................................ 67
3.2 Structuur vh chromosoom .......................................................................................... 69
3.2.1 chromosomale eiwitten / opvouwing DNA ................................................................................... 70
3.2.2 telomeren ...................................................................................................................................... 72

4 RNA & transcriptie................................................................................................... 74
4.1 Transcriptie in PROKARYOTEN ..................................................................................... 74
4.1.1 transcritpie (prokaryoten) ............................................................................................................. 74
4.1.2 RNA polymerase (prokaryoten) ..................................................................................................... 75
4.1.3 initiatie (prokaryoten) ................................................................................................................... 76
4.2 Transcriptie in EUKARYOTEN ....................................................................................... 77
4.2.1 rna-polymerase (eukaryoten) ........................................................................................................ 78



1

, 4.3 tRNA .......................................................................................................................... 79
4.3.1 structuur trna ................................................................................................................................ 79
4.3.2 genetische code = degeneratief .................................................................................................... 80
4.3.3 koppeling az (met trna) ................................................................................................................. 81
4.4 rRNA & de ribosomen ................................................................................................. 82
4.4.1 rRNas + ribosomale EW  ribosomen .......................................................................................... 84
4.5 mRNA ........................................................................................................................ 86
4.5.1 modificaties mRNA (eukaryoten) .................................................................................................. 87
4.5.2 einde eukaryotisch mRNA ............................................................................................................. 88
4.6 Splicing ...................................................................................................................... 90
4.6.1 splicing door spliceosoom ............................................................................................................. 92

5 Eiwitten & de translatie ........................................................................................... 93
5.1 Eiwitten – inleiding ..................................................................................................... 93
5.2 Eiwitsynthese ............................................................................................................. 93
5.2.1 eiwitsynthese bij PROKARYOTEN .................................................................................................. 93
5.2.2 eiwitsynthese bij eukaryoten ...................................................................................................... 100
5.3 De genetische code....................................................................................................102
5.4 Genregulatie in bacteriën (PROKARYOTEN) ................................................................102
5.4.1 induceerbare genen .................................................................................................................... 103
5.5 Genregulatie bij EUKARYOTEN ...................................................................................105
6 Recombinant DNA ..................................................................................................107
6.1 Plasmide klonerings vectoren ....................................................................................107
6.1.1 F plasmiden ................................................................................................................................. 108
6.1.2 R plasmiden ................................................................................................................................. 109
6.1.3 eigenschappen plasmide kloneringsvectoren ............................................................................. 110
6.1.4 voorbeelde plasmide kloneringsvectoren ................................................................................... 110
6.2 Faagvectoren.............................................................................................................117
6.3 Cosmide vectoren ......................................................................................................120




2

,1 Inleiding: biotechnologie
 Gebruik & manipulatie v biologische syst ter (industriële) bereiding v natuurlijke
grondstoffen & biomassa
 Biologische systemen: micro-org, plantaardige/ dierlijke cellen, enzymen geïsoleerd uit
levende wezens
 NIET: traditionele agricultuur & veeteelt
• Kruisen planten & dieren zonder genetische manipulatie ≠ biotech
 mRNA vaccins = geen klassiek biotech prod (want w niet aangemaakt in levende cellen)
 Biotech prod?
• Niet zozeer: wat is product?
• Maar: hoe w prod aangemaakt?
▪ Synthetisch  geen biotech prod
 Biotech prod: potentieel gecontamineerd met vb virussen
 Onderscheid GM’en:
▪ Aangemaakt via chemische synthese
▪ Aangemaakt via biotech processen/ rechtstreeks biologisch

EERSTE PERIODE
 Biologische systemen reeds 1000’en jaren gebruikt
• Tijdperk: op onbewuste wijze gebruik gemaakt v bacteriën & gisten:
▪ Productie levensmiddelen: bier, wijn, kaas, yoghurt, azijn
▪ Eindigt +-1850: L.Pasteur  micro-organismen verantwoordelijk vr
bepaalde omzettingen (suikers => alcohol, verzuring wijn)
• Zo: kon bewust gebruik maken v biologische systemen
• Maar: techniek om contaminaties met vreemde org nog niet
gekend (vreemde org op spontane wijze contaminatie)
• Wijn: als in druivensap verkeerde micro-org  wijnazijn ipv wijn (suikers  azijn
ipv alcohol)
▪ Na Pasteur: doelbewust gisten selecteren  wijn

 Bier brouwen:
• Relatief gecontroleerde manier vr gebruik micro-organismen & gisten
• Omkoken: micro-org die spontaan aanwezig zijn, w afgedood
• Fermentatie: door toevoegen v geselecteerde gisten => prod alcohol + CO2
• Als alle suikers => alcohol  gisten breken af
• Alcohol = toxisch vr gisten  gisten breken af (daarom bier max 13% alc)
• !! toevallige micro-org groeien er bij (toevallige contaminatie) !!




3

,TWEEDE PERIODE
 Start: na ontdekking L. Pasteur
 Introductie industriële processen om grote hoeveelheden glycol, butanol, aceton & CZ
aan te maken + start massaproductie bakkersgist + biologische zuiveringsinstallaties rond
grote steden
• Niet verhinderd door vreemde micro-organismen (niet eigen aan prod)

DERDE PERIODE
 Kennis & gebruik aseptische technieken (= om zaken steriel te doen) (niet makkelijk!) =>
zuivere culturen => farmaceutische prod penicillines
 Farmaceutische prod: ALLES moet STERIEL zijn (= 0 micro-organismen aanwezig!)
(<-> andere biotech prod: steriliteit niet zo belangr  vb waspoeder)
 Sindsdien: metabolieten v tal v micro-org beschreven & geprod

 Biologisch product: geïsoleerd uit levende organismen zonder (genetische) manipulatie
 Biotechnologisch product: deel v biologisch prod  manipulatie
 Recombinante biotechnologisch product: biotech prod  DNA manipulatie

VIERDE PERIODE
 Start: invoer recombinant DNA-technieken & definiteive doorbraak v plantaardige &
dierlijke celculturen in productieprocessen (1970-1980)
 Biotech = veel meer dan DNA-manipulaties
• Biotech <-> DNA-manipulaties: geen synoniemen !!
 Farmaceutische sector: noodzaak aan massaprod v oraal werkzame antimicrobiële
stoffen => ontwikkeling v kiemverbetering & industriële aseptische technieken
• + introductie gebruik dierlijke celculturen in productieproces v vaccins
 Recombinant DNA-technieken = genetic engineering
• = doorbraak in mogelijkheden farmaceutische nijverheid

 DNA manipuleren + (stabiele) wijziging al dan niet in genoom v bepaalde cellen
(bacteriezoogdiercel)
• Recombinante proteïnen aanmaken op industriële schaal
• Lichaamseigen moleculen in grote hoeveelheden
▪ Zo: bepaalde:
• Neuro-endocriene boodschappers (FSH, LH, EGD, insuline,
erythropoietine, enkefaline,..),
• Lymfokines (communicatiemol tss cellen v afweermechanisme, vb
interferons, interleukines,…)
• Bloedproteïnen (stollingsfactoren, trombolytica,
proteaseinhibitoren)
▪ … kunnen wereldwijd klinisch getest w & therapeutisch gebruikt w
 Ook recombinante technieken voor: vaccins, mAb (monoklonale anti-lichamen), enzymen
Gewone biologicals: bloed-afgeleide producten (biologische prod) (geen biotech prod)

Biotech producten: door manipulatie v micro-org, maar zonder wijzigingen DNA

Recombinant: DNA manipulatie, vb insuline


4

, Insuline:




• Normaal in lichaam: in beperkt # cellen gemaakt (alleen in beta-cellen pancreas)
• Gen vr coderen insuline: wel overal
▪ Genoom in hele lichaam zelfde, maar cellen doen versch dingen
▪ Uit-/aanzetten v promotoren (afh v omgevingsfactoren): bepaalt wat
cellen doen

• Startcodon codeert vr Methionine  EW beginnen met Met
• Aanmaak insuline: EW start niet met Met
▪ Door post-translationele modificaties  stuk v EW weg (signaalsequentie
afgeknipt)

• Varkensinsuline verschilt maar 1 AZ met menselijk
▪ Vroeger bij diabetes
▪ 1 AZ verschil = genoeg om als lichaamsvreemd EW herkend te w
• Patiënt maakt antilichamen aan tg varkensinsuline  resistentie 
werkt niet meer


 Analyse vd nieuwe biogene GM’en = extreem belangrijk, kwaliteitscontrole (uitdaging)
• Risico op contaminatie (virussen,..)
▪ Strikte in procescontroles (strengere kwaliteitscontroles) + analyses
• EW’en = complexer dan klassieke GM
▪ Analyse veel moeilijker
▪ Moeilijkere prod’en om mee om te gaan




5

, mAb: monochromaal anti-lichaam
 Structuur v opvouwen = moeilijk te bepalen + niet zo stabiel
 GM’en in frigo/diepvries: gn denaturatie (= irreversibel !!)
• Als GM gedenatureerd is  kan niet terug




6

,2 Basisbegrippen/technieken in biotechnologie & genetica
2.1 DNA-RNA
2.1.1 DNA-STRUCTUUR
 Primaire struct: polynucleotide-struct
• Polynucleotide: door vorming 3’-5’-fosfordiëster verbinding tss nucleotiden
▪ Suiker-fosfaatskelet
▪ Basen op skelet gebonden via koolstof 1’ v suikermolecule (bepalen DNA-
sequentie)

 Secundaire struct: 2 anti-parallelle ketens
• = Watson & Crick model
• Dubbelstrengig
▪ Uitz: vr enkele virussen met enkelstrengig DNA
• 1 streng in 5’3’ richtinhg, andere in 3’5’ richting (anti-
parallel)
• Ketens samengehouden door H-bruggen tss complementaire
basen (basepaarvorming): A-T & G-C
▪ Chargaffregel:
𝐴+𝐺 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑛𝑒𝑠
= =1
𝐶+𝑇 𝑝𝑦𝑟𝑖𝑚𝑖𝑑𝑖𝑛𝑒𝑠




 Veel virussen: enkelstrengig DNA-genoom
• Gebieden v complementariteit met zichzelf —> interne dubbel helix haarspeld
structuren




1 enkele streng bubbels: DNA blijft enkelstrengig omdat
 intern opgeplooid niet intern complementair is (daar)




7

, Veel genomen = circulaire DNA moleculen
• Oa met meeste (/alle) bacteriële genomen, sommige virussen, versch
bacteriofagen & plasmiden
• In bacterie: al het DNA dat je er kan uithalen = circulaire DNA-moleculen
• Voordeel circulaire genomen:
▪ Om te kunnen delen: moeten eerst DNA kunnen verdubbelen
(2 dochtercellen)
▪ Bij circulair DNA: replicatieproces eenvoudiger
▪ <-> mens (zoogdieren): lineair DNA
• Plasmiden: maken niet per se deel uit v genoom!
▪ Kan zelfde bacterie hebben met/zonder plasmiden OF met versch
plasmiden

2.1.2 DENATURATIE – RENATURATIE
 Denaturatie (eiwitten)
• Vb ei koken: vl  vast
▪ EW’en verliezen originele struct
▪ irreversibel
 Denaturatie (DNA)
• Reversibel !!!
▪ Kan renatureren (strengen weer samen)
▪ Kan je onbeperkt herhalen
• Invloeden denaturatie – renaturatie:
▪ Thermisch (verwarmen)
▪ pH wijziging (sterk Z/B)
➢ !! in te sterk Z/B milieu: DNA breekt af
▪ Destabilisatie met ureum, formamide

 Tm waarde/ smelttemp (melting temperature)
• = temp waarbij ½ v basen in duplex ongepaard zijn ( ½ enkelstrengig)
• [G] [C] gehalte , Tm
▪ [G]-[C]: 3 H-bruggen ipv 2 bij [A]-[T]
➢ Betere binding  stabielere binding  moet meer E toevoegen om
te bteken
• Vnl belangr bij renaturatie  afkoelen tot Tm waarde
▪ Als je voll gerenatureerd DNA wil: afkoelen tot ong 25°C onder Tm

 Renaturatie:
• Gedenatureerde strengen die geïncubeerd w bij temp die ong 25°C onder Tm
waarde ligt  gaan reassociëren




8

, Meting/detectie v denaturatie: door UV-spectrofotometrie
• Dubbelstrengig DNA: absorbeert minder UV bij 260 nm dan enkelstrengig DNA 
denaturatieproces kan gevolgd w (want basen bij dubbel streng meer verborgen -
> kunnen minder licht absorberen)
 Poly d(A-T)
• Enkel uit A & T (2 H-bruggen)
• Tot ong 60°C: A blijft zelfde  verder: A (zonder iets toe te voegen)  w
enkelstrengig
• Tm ong 70°C
▪ Op helft curve
▪ ½ enkelstrengig, ½ dubbelstrengig
 DNA
• Tm ong 80°C
▪ Als je voll denaturatie wil: stuk boven 80°C
▪ Als je voll renaturatie wil: stuk onder 80°C
• Alle DNA uit org halen = gedenatureerd???




9

,  UV-spectrometrie (Lambert-Beer)
• Schatting hoeveelheid DNA
• Schatting zuiverheid DNA

 Hoeveelheid DNA:
• 1 OD260nm (OD = optimale densiteit)
▪ = +- 50 µg/ml dubbelstrengig DNA
▪ = +- 33 µg/ml enkelstrengig DNA

 Zuiverheid DNA
• In zuivere DNA prepraties:
Verhouding OD260/OD280 = 1.8


VRAGEN:
1) stel verhouding = 1,5 (<1,8)  DNA = onzuiver
2) stel verhouding = 2,2 (> 1,8)  DNA = onzuiver
➔ zuiver DNA: verhouding = 1,8 (niet meer/minder) (niet “zeer zuiver”)
➔ als absorbantie groter/kleiner dan 1,8: door andere stoffen bij DNA die aborbantie-
spectrum beïnvloeden (verstoren verhouding)

3) stel verhouding = 1,8  weet niet zeker of DNA zuiver is !!
➔ kan nog andere stof in zitten met ong dezelfde verhouding v absorbantie
➔ OF 2 versch onzuiverheden  ene absorbeert meer, andere minder  verh = 1,8




10