Vegetatieve vermeerdering
1.1
In vitro cutuur: cultuur in glas. Bij weefselkweek wordten planten of plantendelen gekweekt op een
kunstmatige voedingsbodem onder steriele omstandigheden. Vele delen van de plant kunnen
gebruikt worden als uitgangsmateriaal: zaden, zaadknoppen, embryo's, endosperm, meristemen,
stengel- of bladstukjes etc. Het plantendeel dat wordt gekozen is afhankelijk van de plant en het
doel. Explantaat: plantendeel dat in vitro wordt gebracht op een kunstmatige voedingsbodem
(medium).
Biologische principes fundamenteel voor weefselkweek:
1. Delen van planten en zelfs geïsoleerde plantencellen hebben het vermogen uit te groeien tot
een complete plant. Deze fundamentele eigenschap wordt aangeduid met de term
totipotentie en is de basisvoorwaarde voor het toepassen van weefselkweek.
2. Groei- en ontwikkelingsprocessen in vitro moeten gecontroleerd en gestuurd worden.
Hiervoor wordt gebruik gemaakt van groeiregulatoren. Deze groeiregulatoren zijn de
natuurlijke plantenhormonen of synthetische verbindingen met een analoge
(overeenkomstige) werking. Ze zijn zeer effectief in het vormgeven van de ontwikkeling in
vitro.
3. De ontwikkeling van het explantaat is op te vatten als een lange serie van celdelingen
(mitosen), die uiteindelijk moet leiden tot een eindproduct. Theoretisch verandert door een
mitose niets aan het erfelijk materiaal waarvan wordt uitgegaan. In de praktijk blijkt dat
deze regel lang niet altijd opgaat en dat er vaak sprake is van genetische instabiliteit.
1.2
Totipotentie is een eigenschap waarbij een cel alle informatie bezit die noodzakelijk is voor e
ontwikkeling van een groot aantal weefseltypen, die op een zodanige wijze zijn geordend dat een
goed functionerende plant ontstaat. Een voorbeeld hiervan is de bevruchte eicel die zich ontplooit
tot volwassen plant.
Meristematische cellen produceren complete stengels of wortels, en geslachtscellen ontstaan ook
uit meristemen. Meristematische cellen zijn dus ook totipotent. Somatische cellen (lichaamscellen of
vegetatieve cellen) zijn gespecialiseerd in functies in het orgaan waar ze voorkomen. Ze ondergaan
geen celdeling meer en zijn niet meer totipotent. Somatische cellen zijn wel afkomstig van
meristematische cellen met totipotentie.
Interpretaties van het verliezen van totipotentie:
1. Tijdens het differentiatieproces gaat de totipotentie verloren doordat de genetische
samenstelling niet in de oorspronkelijke vorm bewaard blijft. Hierbij zijn somatische cellen
niet totipotent.
2. Tijdens het differentiatieproces blijft het genetisch programma intact, alleen wordt een
groot deel ervan geblokkeerd. Alleen het gedeelte dat noodzakelijk is voor het
differentiatieproces blijft actief. De blokkering zou onder juiste omstandigheden opgeheven
kunnen worden en daardoor zouden somatische cellen totipotent zijn. Dit bleek de juiste
interpretatie te zijn. De informatie voor het uitgroeien tot een complete plant ligt in
gecodeerde vorm in het chromosoom opgeslagen. Genetische informatie komt tot
uitdrukking doordat ze vertaald worden door enzymen die de celstofwisseling sturen.
,Omdat somatische cellen totipotent zijn, maar de genetische informatie deels geblokkeerd is, is de
uitgroei van de cellen een kwestie van het kiezen van de juiste omstandigheden. De totipotentie van
somatische cellen kan geactiveerd worden door groeiregulatoren.
1.3
Groeiregulatoren kunnen zeer effectief de groei van plantaardig weefsel stimuleren en zijn in staat
de ontwikkeling te sturen. Groeiregulatoren geven een prikkel om een specifieke
ontwikkelingsmogelijkheid in werking te stellen. Groeiregulatoren zijn plantenhormonen of
synthetische verbindingen die een analoog effect hebben. Hoe planten ontwikkelen komt voort uit
een ingebouwd genetisch programma. Maar de ontwikkelingsmogelijkheden zijn ook afhankelijk van
abiotische factoren als temperatuur, licht gassamenstelling ect. In de weefselkweek kunnen deze
factoren, en daarmee de ontwikkelingsprocessen, gecontroleerd worden. Er bestaan 5 groepen
groeiregulatoren: auxinen, cytokininen, gibberellinen, abscisine zuur (ABA) en ethyleen. Deze
worden in een specifieke plaats in de plant geproduceerd en in een bepaalde richting
getransporteerd. Ze veroorzaken een specifiek effect in de weefsels die daar gevoelig voor zijn. Een
groeiregulator wordt specifiek herkend door bepaalde receptoren op de celmembraan of in het
cytoplasma. Gevoeligheid van weefsel hangt samen met de aanwezigheid van deze receptoren. Er
zijn geen specifieke wortel-, callus- en scheut- inducerende stoffen, maar de relatieve concentraties
van auxine en cytokinine zorgen ervoor dat verschillende weefsels gevormd worden. Een hogere
concentratie auxine zorgt voor wortels, een overmaat aan cytokinine leidt tot scheutvorming. Een
hoge auxine concentratie zorgt voor callusgroei, maar het cytokinine heeft ook invloed. Bij lage
cytokinine is het callus waterig en samengesteld uit grote cellen. Het callus groeit hier vooral door
celvergroting. Bij een hogere cytokinine concentratie zijn de calli dichter en bestaan uit grotere
aantallen kleine, meristematische cellen. Hierbij zorgt de verhoging van de kinetine concentratie dat
de cellen delen. Externe factoren kunnen ook invloed hebben op het werkingsmechanisme van
groeiregulatoren.
Dezelfde concentraties groeiregulatoren hebben een ander effect bij verschillende plantensoorten.
Verschillende plantensoorten hebben een verschillende genetische samenstelling waardoor de
respons op een prikkel anders kan zijn. Er bestaan verschillen tussen interne hormoonconcentraties
bij explantaten van verschillende plantensoorten en verschillende explantaten binnen een plant.
Ook zijn er verschillen in gevoeligheid voor groeiregulatoren door het aantal receptoren.
Auxine en cytokinine zijn antagonisten van elkaar. Andere groepen groeiregulatoren worden
nauwelijks toegepast in de weefselkweek. Bij embryocultuur wordt gibberelline soms gebruikt voor
het opheffen van kiemrust, of voor het strekken van een explantaat. Absicinezuur wordt soms
toegepast om rust te induceren bij somatische embryo's.
Hoofdstuk 2
2.2 Medium
Essentiële bestanddelen van een medium zijn water, minerale zouten (micro- en macro-elementen)
en als het om een vast medium gaat ook agar. Het hoofdbestanddeel van elk medium is
gedestilleerd of gedemineraliseerd water.
Het MS-medium is één van het meest gebruikte medium. Het zoutenmengsel bestaat uit
macrozouten (N, P, K, Ca, Mg, Fe) en microzouten (Mn, Cu, Zn, B, Na, Cl, I, S, Mo, Co, Al en Ni).
Macro en micro verwijzen naar de hoeveelheid van de elementen die de plant nodig heeft. Voor
, zoutgevoelige gewassen moet een zoutarm medium gebruikt worden. De totale ionenconcentratie
kan worden vastgesteld met een berekening, en een laag aantal ionen (in mmol/L) komt overeen
met een lage zoutconcentratie. IJzer is essentieel voor de groei en morfogenese (ontstaan van de
vorm van een plant) van in vitro plantjes.
Bij een vast media wordt agar toegevoegd als stolmiddel. Natuurlijke agar wordt bereid uit
zeewieren en wordt gebruikt in een concentratie van ca. 0,7%. Synthetische agar, bijv CASAGAR,
wordt in een concentratie van 0,2% gebruikt. Het voordeel van synthetische agar is dat de
samenstelling constant is, minder verontreinigingen heeft en transparant is. In tegenstelling tot de
natuurlijke agar die troebel is. In transparant agar is het opsporen van infecties makkelijker. Bij
CASAGAR zijn voldoende 2-waardige kationen nodig (Ca2+ en Mg2+). Bij een te lage concentratie
zouten zal geen stolling optreden.
Omdat de fotosynthese nog niet optimaal is hebben in vitro plantjes een koolstofbron nodig. De
planten kunnen dit ook uit CO2 halen, maar tijdens de standaard weefselkweek wordt minder
aandacht besteed aan lichtcondities en luchtsamenstelling in de kweekcontainer waardoor weefsel
afhankelijk blijft van de koolstofbron in het medium. Als energiebron kunnen glucose, sucrose en
fructose toegediend worden. Naast energiebron is suiker ook belangrijk voor het op peil houden van
de osmotische waarde van het medium. Bij kwetsbare explantaten, zoals protoplasten en
microsporen, is dit extra belangrijk. Bij tabak vindt de beste productie van scheuten plaats ij een
osmotische waarde die wordt verkregen door een suikergehalte tussen 2% en 4%. Bij Liliaceae zien
we bij 30 g/l sucrose dat 100% van de scheut-top-explantaten bolletjes vormen. Bij 90 g/l sucrose
wordt bij 10% van de explantaten bolletjes gevormd, de overige bolletjes vormen callus. Bij de hoge
concentratie sucrose was de rhizogenese (vorming van wortels) beter dan bij 30 g/l.
De vitaminen die een in vitro plantje nodig heeft kan het vaak zelf maken als er voldoende N
beschikbaar is. Soms worden ze uit voorzorg toegediend. Een toevoeging van vitaminen kan de groei
van een explantaat ook verbeteren.
Eén van de fundamentele reguleringsmeganismen in de organogenese is de verhouding tussen
cytokininen en auxinen. Een hoge ratio auxine t.o.v. cytokinine bevorderd de wortelvorming, en het
tegenovergestelde bevorderd de scheutvorming. Tussenliggende verhoudingen induceren callus. De
synthetische auxine 2,3-D wordt vaak gebruikt voor de inductie van callus, maar dit heeft ook
nadelige eigenschappen: soms wordt morfogenese geremd of negatief beïnvloed, het kan mutaties
induceren en veelal wordt de fotosynthese in vitro erdoor geremd. Het belang van cytokinine is sterk
afhankelijk van het plantenweefsel. Er zijn aanwijzingen dat de behoefte aan cytokininen genetisch
bepaald is. Daarnaast kan er gewenning (habituatie) optreden waardoor culturen na verloop van tijd
minder behoefte aan de regulator hebben. Deze verandering is waarschijnlijk epigenetisch.
Gibberellinen hebben een remmend effect op scheut- en wortelgroei. Soms zijn ze evorderlijk voor
de strekking van internodiën en het doorbreken van kiemrust. Ze worden daarom gebruikt bij het uit
laten lopen van bloemknoppen en bij embryocultuur. Gibberellinen zijn thermolabiel en kunnen dus
niet gesteriliseerd worden in een autoclaaf. Hierdoor is filtersterilisatie nodig. Abscisinezuur (ABA)
heeft een negatieve invloed op de morfogenese. Soms is het bevorderlijk voor callusgroei en
embryogenese. ABA wordt gebruikt voor het geschikt maken van het weefsel voor cryopreservation,
bewaring van biologisch materiaal bij zeer lage temperatuur.
Aminozuren kan de plant vaak ook zelf maken, maar er zijn enkele uitzonderingen waardoor er
bepaalde organische stoffen aan het medium toegevoegd worden. Kokosmelk bevordert bij veel
gewassen de groei, celdeling en differentiatie doordat het cytokinine, vrije aminozuren en myo-
inositol (speelt een rol bij de synthese van fosfolipiden, celwandpectine en cytoplasmatische
1.1
In vitro cutuur: cultuur in glas. Bij weefselkweek wordten planten of plantendelen gekweekt op een
kunstmatige voedingsbodem onder steriele omstandigheden. Vele delen van de plant kunnen
gebruikt worden als uitgangsmateriaal: zaden, zaadknoppen, embryo's, endosperm, meristemen,
stengel- of bladstukjes etc. Het plantendeel dat wordt gekozen is afhankelijk van de plant en het
doel. Explantaat: plantendeel dat in vitro wordt gebracht op een kunstmatige voedingsbodem
(medium).
Biologische principes fundamenteel voor weefselkweek:
1. Delen van planten en zelfs geïsoleerde plantencellen hebben het vermogen uit te groeien tot
een complete plant. Deze fundamentele eigenschap wordt aangeduid met de term
totipotentie en is de basisvoorwaarde voor het toepassen van weefselkweek.
2. Groei- en ontwikkelingsprocessen in vitro moeten gecontroleerd en gestuurd worden.
Hiervoor wordt gebruik gemaakt van groeiregulatoren. Deze groeiregulatoren zijn de
natuurlijke plantenhormonen of synthetische verbindingen met een analoge
(overeenkomstige) werking. Ze zijn zeer effectief in het vormgeven van de ontwikkeling in
vitro.
3. De ontwikkeling van het explantaat is op te vatten als een lange serie van celdelingen
(mitosen), die uiteindelijk moet leiden tot een eindproduct. Theoretisch verandert door een
mitose niets aan het erfelijk materiaal waarvan wordt uitgegaan. In de praktijk blijkt dat
deze regel lang niet altijd opgaat en dat er vaak sprake is van genetische instabiliteit.
1.2
Totipotentie is een eigenschap waarbij een cel alle informatie bezit die noodzakelijk is voor e
ontwikkeling van een groot aantal weefseltypen, die op een zodanige wijze zijn geordend dat een
goed functionerende plant ontstaat. Een voorbeeld hiervan is de bevruchte eicel die zich ontplooit
tot volwassen plant.
Meristematische cellen produceren complete stengels of wortels, en geslachtscellen ontstaan ook
uit meristemen. Meristematische cellen zijn dus ook totipotent. Somatische cellen (lichaamscellen of
vegetatieve cellen) zijn gespecialiseerd in functies in het orgaan waar ze voorkomen. Ze ondergaan
geen celdeling meer en zijn niet meer totipotent. Somatische cellen zijn wel afkomstig van
meristematische cellen met totipotentie.
Interpretaties van het verliezen van totipotentie:
1. Tijdens het differentiatieproces gaat de totipotentie verloren doordat de genetische
samenstelling niet in de oorspronkelijke vorm bewaard blijft. Hierbij zijn somatische cellen
niet totipotent.
2. Tijdens het differentiatieproces blijft het genetisch programma intact, alleen wordt een
groot deel ervan geblokkeerd. Alleen het gedeelte dat noodzakelijk is voor het
differentiatieproces blijft actief. De blokkering zou onder juiste omstandigheden opgeheven
kunnen worden en daardoor zouden somatische cellen totipotent zijn. Dit bleek de juiste
interpretatie te zijn. De informatie voor het uitgroeien tot een complete plant ligt in
gecodeerde vorm in het chromosoom opgeslagen. Genetische informatie komt tot
uitdrukking doordat ze vertaald worden door enzymen die de celstofwisseling sturen.
,Omdat somatische cellen totipotent zijn, maar de genetische informatie deels geblokkeerd is, is de
uitgroei van de cellen een kwestie van het kiezen van de juiste omstandigheden. De totipotentie van
somatische cellen kan geactiveerd worden door groeiregulatoren.
1.3
Groeiregulatoren kunnen zeer effectief de groei van plantaardig weefsel stimuleren en zijn in staat
de ontwikkeling te sturen. Groeiregulatoren geven een prikkel om een specifieke
ontwikkelingsmogelijkheid in werking te stellen. Groeiregulatoren zijn plantenhormonen of
synthetische verbindingen die een analoog effect hebben. Hoe planten ontwikkelen komt voort uit
een ingebouwd genetisch programma. Maar de ontwikkelingsmogelijkheden zijn ook afhankelijk van
abiotische factoren als temperatuur, licht gassamenstelling ect. In de weefselkweek kunnen deze
factoren, en daarmee de ontwikkelingsprocessen, gecontroleerd worden. Er bestaan 5 groepen
groeiregulatoren: auxinen, cytokininen, gibberellinen, abscisine zuur (ABA) en ethyleen. Deze
worden in een specifieke plaats in de plant geproduceerd en in een bepaalde richting
getransporteerd. Ze veroorzaken een specifiek effect in de weefsels die daar gevoelig voor zijn. Een
groeiregulator wordt specifiek herkend door bepaalde receptoren op de celmembraan of in het
cytoplasma. Gevoeligheid van weefsel hangt samen met de aanwezigheid van deze receptoren. Er
zijn geen specifieke wortel-, callus- en scheut- inducerende stoffen, maar de relatieve concentraties
van auxine en cytokinine zorgen ervoor dat verschillende weefsels gevormd worden. Een hogere
concentratie auxine zorgt voor wortels, een overmaat aan cytokinine leidt tot scheutvorming. Een
hoge auxine concentratie zorgt voor callusgroei, maar het cytokinine heeft ook invloed. Bij lage
cytokinine is het callus waterig en samengesteld uit grote cellen. Het callus groeit hier vooral door
celvergroting. Bij een hogere cytokinine concentratie zijn de calli dichter en bestaan uit grotere
aantallen kleine, meristematische cellen. Hierbij zorgt de verhoging van de kinetine concentratie dat
de cellen delen. Externe factoren kunnen ook invloed hebben op het werkingsmechanisme van
groeiregulatoren.
Dezelfde concentraties groeiregulatoren hebben een ander effect bij verschillende plantensoorten.
Verschillende plantensoorten hebben een verschillende genetische samenstelling waardoor de
respons op een prikkel anders kan zijn. Er bestaan verschillen tussen interne hormoonconcentraties
bij explantaten van verschillende plantensoorten en verschillende explantaten binnen een plant.
Ook zijn er verschillen in gevoeligheid voor groeiregulatoren door het aantal receptoren.
Auxine en cytokinine zijn antagonisten van elkaar. Andere groepen groeiregulatoren worden
nauwelijks toegepast in de weefselkweek. Bij embryocultuur wordt gibberelline soms gebruikt voor
het opheffen van kiemrust, of voor het strekken van een explantaat. Absicinezuur wordt soms
toegepast om rust te induceren bij somatische embryo's.
Hoofdstuk 2
2.2 Medium
Essentiële bestanddelen van een medium zijn water, minerale zouten (micro- en macro-elementen)
en als het om een vast medium gaat ook agar. Het hoofdbestanddeel van elk medium is
gedestilleerd of gedemineraliseerd water.
Het MS-medium is één van het meest gebruikte medium. Het zoutenmengsel bestaat uit
macrozouten (N, P, K, Ca, Mg, Fe) en microzouten (Mn, Cu, Zn, B, Na, Cl, I, S, Mo, Co, Al en Ni).
Macro en micro verwijzen naar de hoeveelheid van de elementen die de plant nodig heeft. Voor
, zoutgevoelige gewassen moet een zoutarm medium gebruikt worden. De totale ionenconcentratie
kan worden vastgesteld met een berekening, en een laag aantal ionen (in mmol/L) komt overeen
met een lage zoutconcentratie. IJzer is essentieel voor de groei en morfogenese (ontstaan van de
vorm van een plant) van in vitro plantjes.
Bij een vast media wordt agar toegevoegd als stolmiddel. Natuurlijke agar wordt bereid uit
zeewieren en wordt gebruikt in een concentratie van ca. 0,7%. Synthetische agar, bijv CASAGAR,
wordt in een concentratie van 0,2% gebruikt. Het voordeel van synthetische agar is dat de
samenstelling constant is, minder verontreinigingen heeft en transparant is. In tegenstelling tot de
natuurlijke agar die troebel is. In transparant agar is het opsporen van infecties makkelijker. Bij
CASAGAR zijn voldoende 2-waardige kationen nodig (Ca2+ en Mg2+). Bij een te lage concentratie
zouten zal geen stolling optreden.
Omdat de fotosynthese nog niet optimaal is hebben in vitro plantjes een koolstofbron nodig. De
planten kunnen dit ook uit CO2 halen, maar tijdens de standaard weefselkweek wordt minder
aandacht besteed aan lichtcondities en luchtsamenstelling in de kweekcontainer waardoor weefsel
afhankelijk blijft van de koolstofbron in het medium. Als energiebron kunnen glucose, sucrose en
fructose toegediend worden. Naast energiebron is suiker ook belangrijk voor het op peil houden van
de osmotische waarde van het medium. Bij kwetsbare explantaten, zoals protoplasten en
microsporen, is dit extra belangrijk. Bij tabak vindt de beste productie van scheuten plaats ij een
osmotische waarde die wordt verkregen door een suikergehalte tussen 2% en 4%. Bij Liliaceae zien
we bij 30 g/l sucrose dat 100% van de scheut-top-explantaten bolletjes vormen. Bij 90 g/l sucrose
wordt bij 10% van de explantaten bolletjes gevormd, de overige bolletjes vormen callus. Bij de hoge
concentratie sucrose was de rhizogenese (vorming van wortels) beter dan bij 30 g/l.
De vitaminen die een in vitro plantje nodig heeft kan het vaak zelf maken als er voldoende N
beschikbaar is. Soms worden ze uit voorzorg toegediend. Een toevoeging van vitaminen kan de groei
van een explantaat ook verbeteren.
Eén van de fundamentele reguleringsmeganismen in de organogenese is de verhouding tussen
cytokininen en auxinen. Een hoge ratio auxine t.o.v. cytokinine bevorderd de wortelvorming, en het
tegenovergestelde bevorderd de scheutvorming. Tussenliggende verhoudingen induceren callus. De
synthetische auxine 2,3-D wordt vaak gebruikt voor de inductie van callus, maar dit heeft ook
nadelige eigenschappen: soms wordt morfogenese geremd of negatief beïnvloed, het kan mutaties
induceren en veelal wordt de fotosynthese in vitro erdoor geremd. Het belang van cytokinine is sterk
afhankelijk van het plantenweefsel. Er zijn aanwijzingen dat de behoefte aan cytokininen genetisch
bepaald is. Daarnaast kan er gewenning (habituatie) optreden waardoor culturen na verloop van tijd
minder behoefte aan de regulator hebben. Deze verandering is waarschijnlijk epigenetisch.
Gibberellinen hebben een remmend effect op scheut- en wortelgroei. Soms zijn ze evorderlijk voor
de strekking van internodiën en het doorbreken van kiemrust. Ze worden daarom gebruikt bij het uit
laten lopen van bloemknoppen en bij embryocultuur. Gibberellinen zijn thermolabiel en kunnen dus
niet gesteriliseerd worden in een autoclaaf. Hierdoor is filtersterilisatie nodig. Abscisinezuur (ABA)
heeft een negatieve invloed op de morfogenese. Soms is het bevorderlijk voor callusgroei en
embryogenese. ABA wordt gebruikt voor het geschikt maken van het weefsel voor cryopreservation,
bewaring van biologisch materiaal bij zeer lage temperatuur.
Aminozuren kan de plant vaak ook zelf maken, maar er zijn enkele uitzonderingen waardoor er
bepaalde organische stoffen aan het medium toegevoegd worden. Kokosmelk bevordert bij veel
gewassen de groei, celdeling en differentiatie doordat het cytokinine, vrije aminozuren en myo-
inositol (speelt een rol bij de synthese van fosfolipiden, celwandpectine en cytoplasmatische
