Eiwitten: gel-elektroforese en kwantitatieve
bepaling
Samenvatting
In dit practicum hebben we twee experimenten uitgevoerd. Als eerste hebben we onderzoek
gedaan naar een eiwit door middel van SDS-PAGE en Western Blot. Hierdoor probeerden we
erachter te komen wat het molecuulgewicht van dit eiwit is, of het eiwit uit meerdere sub-units
bestaat, of die sub-units aan elkaar zitten met zwavelbruggen en hoe de structuur van het eiwit
eruitziet. Bij het eerste experiment kwamen we erachter dat eiwit X een gewicht heeft van 25
kDa en eiwit Y van ongeveer 300 kDa, ook bestond eiwit Y uit 6 sub-units verbonden door
zwavelbruggen.
In het tweede experiment hebben we een kwantitatieve eiwitbepaling volgens Lowry gedaan.
Hierdoor wilden we erachter komen wat de eiwitconcentratie in kalverserum is. Uit onze
berekeningen bleek de eiwitconcentratie van het kalverserum 43,6 g/L te zijn.
Inleiding
In het eerste experiment wordt onderzoek gedaan naar een eiwit in een eiwitmengsel met
behulp van SDS-PAGE en Western Blot.
SDS-PAGE is een methode om eiwitten op basis van grootte te scheiden. SDS bindt non-
covalent aan eiwitten waardoor de eiwitten uniform negatief geladen worden en in de gel naar
de positieve pool getrokken zullen worden. De eiwitten worden aangebracht op een gel van
gepolymeriseerd acrylamide, deze gel heeft een soort zeefwerking wat de eiwitten op grootte
scheidt. De kleinste eiwitten bewegen het makkelijkst door de gel en zullen het laagst eindigen.
De gel bestaat uit twee delen een zogenaamd stacking gedeelte en een separating gedeelte.
Het stacking gedeelte bevat een laag percentage polyacrylamide (grof netwerk) waardoor alle
eiwitten worden samengedrukt en tegelijk aankomen bij het tweede gedeelte van de gel, het
separating gedeelte. Het separating gedeelte heeft een hoog percentage polyacrylamide (fijn
netwerk) en hier vindt de eigenlijke scheiding van eiwitten op basis van grootte plaats.
Western blotting is een techniek waarmee een specifiek eiwit in een eiwitmengsel kan worden
geïdentificeerd met behulp van antilichamen. Eiwitten, die gescheiden zijn door SDS-PAGE,
worden elektroforetisch overgebracht op een membraan. Het eiwit wordt zichtbaar gemaakt
(=blotten) door het membraan te incuberen met een antilichaam dat aan eiwit van interesse
bindt. Het antilichaam is gelabeld met een fluorescente groep of een enzym. Met deze
methodes proberen we het molecuulgewicht van een specifiek eiwit te bepalen en te bepalen of
een eiwit uit meerdere sub-units bestaat die met zwavelbrug(gen) aan elkaar vast zitten en of
we een idee kunnen krijgen van de structuur van het eiwitcomplex. Bij het tweede experiment
maken we gebruik van spectrofotometrie om de concentratie van een stof te bepalen. Er wordt
door een spectrofotometer gemeten hoeveel licht van een bepaalde golflengte door een stof
wordt geabsorbeerd. Aan de hand van de hoeveelheid licht die wordt geabsorbeerd kan de
concentratie van de stof bepaald worden.
1
bepaling
Samenvatting
In dit practicum hebben we twee experimenten uitgevoerd. Als eerste hebben we onderzoek
gedaan naar een eiwit door middel van SDS-PAGE en Western Blot. Hierdoor probeerden we
erachter te komen wat het molecuulgewicht van dit eiwit is, of het eiwit uit meerdere sub-units
bestaat, of die sub-units aan elkaar zitten met zwavelbruggen en hoe de structuur van het eiwit
eruitziet. Bij het eerste experiment kwamen we erachter dat eiwit X een gewicht heeft van 25
kDa en eiwit Y van ongeveer 300 kDa, ook bestond eiwit Y uit 6 sub-units verbonden door
zwavelbruggen.
In het tweede experiment hebben we een kwantitatieve eiwitbepaling volgens Lowry gedaan.
Hierdoor wilden we erachter komen wat de eiwitconcentratie in kalverserum is. Uit onze
berekeningen bleek de eiwitconcentratie van het kalverserum 43,6 g/L te zijn.
Inleiding
In het eerste experiment wordt onderzoek gedaan naar een eiwit in een eiwitmengsel met
behulp van SDS-PAGE en Western Blot.
SDS-PAGE is een methode om eiwitten op basis van grootte te scheiden. SDS bindt non-
covalent aan eiwitten waardoor de eiwitten uniform negatief geladen worden en in de gel naar
de positieve pool getrokken zullen worden. De eiwitten worden aangebracht op een gel van
gepolymeriseerd acrylamide, deze gel heeft een soort zeefwerking wat de eiwitten op grootte
scheidt. De kleinste eiwitten bewegen het makkelijkst door de gel en zullen het laagst eindigen.
De gel bestaat uit twee delen een zogenaamd stacking gedeelte en een separating gedeelte.
Het stacking gedeelte bevat een laag percentage polyacrylamide (grof netwerk) waardoor alle
eiwitten worden samengedrukt en tegelijk aankomen bij het tweede gedeelte van de gel, het
separating gedeelte. Het separating gedeelte heeft een hoog percentage polyacrylamide (fijn
netwerk) en hier vindt de eigenlijke scheiding van eiwitten op basis van grootte plaats.
Western blotting is een techniek waarmee een specifiek eiwit in een eiwitmengsel kan worden
geïdentificeerd met behulp van antilichamen. Eiwitten, die gescheiden zijn door SDS-PAGE,
worden elektroforetisch overgebracht op een membraan. Het eiwit wordt zichtbaar gemaakt
(=blotten) door het membraan te incuberen met een antilichaam dat aan eiwit van interesse
bindt. Het antilichaam is gelabeld met een fluorescente groep of een enzym. Met deze
methodes proberen we het molecuulgewicht van een specifiek eiwit te bepalen en te bepalen of
een eiwit uit meerdere sub-units bestaat die met zwavelbrug(gen) aan elkaar vast zitten en of
we een idee kunnen krijgen van de structuur van het eiwitcomplex. Bij het tweede experiment
maken we gebruik van spectrofotometrie om de concentratie van een stof te bepalen. Er wordt
door een spectrofotometer gemeten hoeveel licht van een bepaalde golflengte door een stof
wordt geabsorbeerd. Aan de hand van de hoeveelheid licht die wordt geabsorbeerd kan de
concentratie van de stof bepaald worden.
1
