Moleculaire biologie Les 8
Concept 19.1 DNA sequencing en kloning
Sequencing, hiermee bepaal je de sequentie van DNA. Dit is allemaal begonnen met Sanger
sequencing (dideoxy sequencing). Tegenwoordig gebruiken we met name Next Generation
Sequencing (NGS) wat we vooral gebruiken voor grote stukken DNA, bv het hele genoom. We kennen
hierop meerdere varianten, maar het principe is hetzelfde.
NGS, dit bestaat uit meerdere stappen:
1. Het genoom wordt uit de cel gehaald en
gefragmenteerd.
2. Elk fragment wordt geisoleerd aan een klein
bolletje, bead. Zodat je een druppel krijgt
met één stukje DNA en een bead.
3. Door gebruik van PCR zorg je ervoor dat er
heel veel kopieën aan het balletje komen.
4. Dit balletje wordt nu in een welletje in de
plaat geplaatst met DNA polymerases en
primers.
5. In elk welletje zit nu één bead met steeds
hetzelfde DNA en daaraan worden dan
steeds verschillende vloeistoffen toegevoegd
van de vier nucleotiden en weer afgezogen.
De primer is er al, als de eerstvolgende
nucleotide dan een A is, wordt deze eraan gezet zodra de vloeistof met A aanwezig is.
6. Bij het aanzetten van een base wordt pyrofosfaat (PP i) afgescheiden en dat geeft een heel
klein lichtflitsje. Bij een bead worden er dan meerdere nucleotide tegelijk gebonden wat
weer een sterkere lichtflits oplevert en het apparaat kan dit waarnemen.
7. Als er geen nucleotide gebonden wordt, heb je ook geen lichtflits.
8. Het proces wordt herhaald tot elk fragment een complete complementaire strand heeft en
het patroon van lichtflitsen geeft dan de sequentie aan. Als er 2 keer zoveel nucleotiden
ingebouwd worden, krijg je een twee keer zo hoog signaal.
Gen klonering, wordt gebruik voor het produceren van genen (DNA) of juist de producten daarvan
(eiwitten). Zo kan je genen inbouwen bij planten om ze resistent te maken of genen inbouwen bij
bacteriën zodat ze toxisch afval kunnen afbreken. Ook kan je groeihormonen aan kinderen geven die
achterlopen in de groei of eiwitten toedienen die bloedpropjes oplossen. Deze techniek bestaat ook
weer uit meerdere stappen:
1. Je haalt het betreffende gen uit een cel en zet zit in een plasmide.
2. Het plasmide wordt in een bacterie gezet (transformatie).
3. De bacterie wordt vermenigvuldigd (vermeerdering).
Nu heb je bacteriën die het betreffende gen bevatten en de eiwitten daarvan aanmaken.
, Restrictie enzymen, eiwitten die in DNA knippen op een hele specifieke
sequentie. Dit zijn dus endonucleases, aangezien ze middenin een stuk DNA
knippen. Ze komen vaak uit bacteriën en de naam is daar dan ook vandaan
gehaald. Ook dit proces is weer in meerdere stappen op te delen:
1. De enzymen gaan dan zoek naar een palindroom sequentie en als
deze gevonden is knippen ze het door.
2. Het knippen heeft ‘sticky ends’ opgeleverd en als deze complementair
zijn aan een stukje DNA kan dat ingebouwd worden.
3. Ligase gaat dan over het DNA heen en dicht de gaten.
Palindroom sequentie, kan je vanaf beide kanten hetzelfde lezen.
Zo zie je in de afbeelding twee keer GAATTC.
Sticky ends, je hebt een stukje DNA wat enkelstrengs is en wil
hybridiseren. We kennen sticky ends met een 5’ overhang en
3’ overhang.
Blunt ends, het DNA wordt aan alle twee de kanten op
dezelfde positie doorgeknipt waardoor je geen enkelstrengs DNA krijgt.
DNA gel elektroforese, hiermee kan je DNA scheiden omdat kleine
fragmenten sneller door de gel gaan dan grote fragmenten. De fragmenten
kan je daarna kleuren met ethidium bromide wat aan het DNA bindt en
fluorescent is bij UV-licht. Vaak laat je ook een marker meelopen met
bekende gewichten zodat je deze kan vergelijken met het onderzochte DNA.
PCR, polymerase chain reaction, hiermee kan je genen
vermeerderen:
1. Het DNA wat je wil vermeerderen ga je verhitten (±95 C°),
waardoor de waterbruggen kapotgaan en het DNA
enkelstrengs wordt.
2. Je verlaagt de temperatuur tot ±60 °C en voegt primers
toe die gaan hybridiseren aan het complementaire DNA.
3. Je verhoogt de temperatuur weer een beetje tot ±72 °C
waarna elongatie plaats zal vinden door DNA polymerase.
4. Je verhoogt de temperatuur weer tot ±95 °C waardoor dit
DNA ook weer uit elkaar gaat.
5. Je laat de temperatuur weer een beetje zakken tot ±60 °C
waardoor er weer primers zullen binden.
6. Je verhoogt de temperatuur weer een beetje tot ±72 °C
waarna opnieuw elongatie plaats zal vinden en dit keer
dus ook op de nieuwgevormde DNA strengen van cyclus 1.
Hiermee ga je door en na 30 cyclussen hebben je al meer dan 10 9
moleculen die overeenkomen met de target sequence. Met deze
temperaturen zou de DNA polymerase uit ons lichaam niet
functioneren. We gebruiken hiervoor dan ook een hitte resistent
polymerase uit Thermus Aquatius die in vulkanische bronnen leeft.
Aan het begin van een primer kunnen we een stukje sequentie
toevoegen. Dat hybridiseert niet helemaal goed, maar dat is niet
erg, aangezien het aan de buitenkant zit. Hiermee kunnen we
Hoort niet
knip-/restrictiesites toevoegen waardoor je sticky ends kan
persé bij PCR
krijgen. De DNA stukjes die je hierdoor krijgt kan je in plasmiden
zetten die je daarna toevoegt aan bacteriën. De bacteriën
hebben hier echter niet zo veel aan en delen zelfs minder snel
door de plasmide dus heb je de kans dat ze de plasmiden
verwerpen. Vandaar dat we antibioticaresistentie toevoegen aan
Concept 19.1 DNA sequencing en kloning
Sequencing, hiermee bepaal je de sequentie van DNA. Dit is allemaal begonnen met Sanger
sequencing (dideoxy sequencing). Tegenwoordig gebruiken we met name Next Generation
Sequencing (NGS) wat we vooral gebruiken voor grote stukken DNA, bv het hele genoom. We kennen
hierop meerdere varianten, maar het principe is hetzelfde.
NGS, dit bestaat uit meerdere stappen:
1. Het genoom wordt uit de cel gehaald en
gefragmenteerd.
2. Elk fragment wordt geisoleerd aan een klein
bolletje, bead. Zodat je een druppel krijgt
met één stukje DNA en een bead.
3. Door gebruik van PCR zorg je ervoor dat er
heel veel kopieën aan het balletje komen.
4. Dit balletje wordt nu in een welletje in de
plaat geplaatst met DNA polymerases en
primers.
5. In elk welletje zit nu één bead met steeds
hetzelfde DNA en daaraan worden dan
steeds verschillende vloeistoffen toegevoegd
van de vier nucleotiden en weer afgezogen.
De primer is er al, als de eerstvolgende
nucleotide dan een A is, wordt deze eraan gezet zodra de vloeistof met A aanwezig is.
6. Bij het aanzetten van een base wordt pyrofosfaat (PP i) afgescheiden en dat geeft een heel
klein lichtflitsje. Bij een bead worden er dan meerdere nucleotide tegelijk gebonden wat
weer een sterkere lichtflits oplevert en het apparaat kan dit waarnemen.
7. Als er geen nucleotide gebonden wordt, heb je ook geen lichtflits.
8. Het proces wordt herhaald tot elk fragment een complete complementaire strand heeft en
het patroon van lichtflitsen geeft dan de sequentie aan. Als er 2 keer zoveel nucleotiden
ingebouwd worden, krijg je een twee keer zo hoog signaal.
Gen klonering, wordt gebruik voor het produceren van genen (DNA) of juist de producten daarvan
(eiwitten). Zo kan je genen inbouwen bij planten om ze resistent te maken of genen inbouwen bij
bacteriën zodat ze toxisch afval kunnen afbreken. Ook kan je groeihormonen aan kinderen geven die
achterlopen in de groei of eiwitten toedienen die bloedpropjes oplossen. Deze techniek bestaat ook
weer uit meerdere stappen:
1. Je haalt het betreffende gen uit een cel en zet zit in een plasmide.
2. Het plasmide wordt in een bacterie gezet (transformatie).
3. De bacterie wordt vermenigvuldigd (vermeerdering).
Nu heb je bacteriën die het betreffende gen bevatten en de eiwitten daarvan aanmaken.
, Restrictie enzymen, eiwitten die in DNA knippen op een hele specifieke
sequentie. Dit zijn dus endonucleases, aangezien ze middenin een stuk DNA
knippen. Ze komen vaak uit bacteriën en de naam is daar dan ook vandaan
gehaald. Ook dit proces is weer in meerdere stappen op te delen:
1. De enzymen gaan dan zoek naar een palindroom sequentie en als
deze gevonden is knippen ze het door.
2. Het knippen heeft ‘sticky ends’ opgeleverd en als deze complementair
zijn aan een stukje DNA kan dat ingebouwd worden.
3. Ligase gaat dan over het DNA heen en dicht de gaten.
Palindroom sequentie, kan je vanaf beide kanten hetzelfde lezen.
Zo zie je in de afbeelding twee keer GAATTC.
Sticky ends, je hebt een stukje DNA wat enkelstrengs is en wil
hybridiseren. We kennen sticky ends met een 5’ overhang en
3’ overhang.
Blunt ends, het DNA wordt aan alle twee de kanten op
dezelfde positie doorgeknipt waardoor je geen enkelstrengs DNA krijgt.
DNA gel elektroforese, hiermee kan je DNA scheiden omdat kleine
fragmenten sneller door de gel gaan dan grote fragmenten. De fragmenten
kan je daarna kleuren met ethidium bromide wat aan het DNA bindt en
fluorescent is bij UV-licht. Vaak laat je ook een marker meelopen met
bekende gewichten zodat je deze kan vergelijken met het onderzochte DNA.
PCR, polymerase chain reaction, hiermee kan je genen
vermeerderen:
1. Het DNA wat je wil vermeerderen ga je verhitten (±95 C°),
waardoor de waterbruggen kapotgaan en het DNA
enkelstrengs wordt.
2. Je verlaagt de temperatuur tot ±60 °C en voegt primers
toe die gaan hybridiseren aan het complementaire DNA.
3. Je verhoogt de temperatuur weer een beetje tot ±72 °C
waarna elongatie plaats zal vinden door DNA polymerase.
4. Je verhoogt de temperatuur weer tot ±95 °C waardoor dit
DNA ook weer uit elkaar gaat.
5. Je laat de temperatuur weer een beetje zakken tot ±60 °C
waardoor er weer primers zullen binden.
6. Je verhoogt de temperatuur weer een beetje tot ±72 °C
waarna opnieuw elongatie plaats zal vinden en dit keer
dus ook op de nieuwgevormde DNA strengen van cyclus 1.
Hiermee ga je door en na 30 cyclussen hebben je al meer dan 10 9
moleculen die overeenkomen met de target sequence. Met deze
temperaturen zou de DNA polymerase uit ons lichaam niet
functioneren. We gebruiken hiervoor dan ook een hitte resistent
polymerase uit Thermus Aquatius die in vulkanische bronnen leeft.
Aan het begin van een primer kunnen we een stukje sequentie
toevoegen. Dat hybridiseert niet helemaal goed, maar dat is niet
erg, aangezien het aan de buitenkant zit. Hiermee kunnen we
Hoort niet
knip-/restrictiesites toevoegen waardoor je sticky ends kan
persé bij PCR
krijgen. De DNA stukjes die je hierdoor krijgt kan je in plasmiden
zetten die je daarna toevoegt aan bacteriën. De bacteriën
hebben hier echter niet zo veel aan en delen zelfs minder snel
door de plasmide dus heb je de kans dat ze de plasmiden
verwerpen. Vandaar dat we antibioticaresistentie toevoegen aan
