Moleculair Biologische Technieken Les 1: algemene DNA-technieken
Kennis van het genoom (complete genetische samenstelling van een organisme, cel of virus):
- Isolatie:
- Manipulatie:
- Amplificatie: vermenigvuldigen van een stuk DNA
- Analyse:
Kloneren = het produceren van genetische identieke dieren, planten, cellen, bacteriën etc.
Veel voorkomende DNA-bewerkingen
- Copying:
- Cutting
- Rearranging
Amplificatie door bacteriën:
Bacteriën bevatten plasmiden die opengeknipt kunnen worden waarna er aan de sticky sides
een nieuw stukje DNA kan worden toegevoegd. Dit wordt dan weer teruggezet in de
bacterie waarna het zich gaat vermenigvuldigen met het nieuwe stukje DNA. Dit DNA wordt
dus ook weer doorgegeven aan de nieuwe bacteriën. Deze bacteriën kunnen bijvoorbeeld
weer worden gebruikt om olie op te ruimen na
een olieramp. Ook kunnen de de proteïnen
worden gebruikt om bijvoorbeeld een
groeifactor voor de mens te creëren.
Recombinant DNA technologie: natuurlijke
processen nabootsen in het lab om nieuwe
combinaties van DNA te creëren.
Enzymen Typen enzymen
Specifieke actie Nucleases (restrictie enzymen) – knippen
Voorspelbare actie Modificatoren – Bewerken
Controleerbaar Ligases – plakken
Makkelijk verkrijgbaar Plymerases - kopieren
Verschillende nucleases (enzymen die nucleïnezuren afbreken):
- Exo- en endo nucleases (exo knippen de zijkanten eraf, endo in het midden)
- DNA en RNA nucleases (RNA door de nucleasen Ribonucleasen en DNA door de
nucleasen Desoxyribonucleasen)
- Singlestrand en Dubbelstrand nucleases
- Specifiek en aspecifieke nucleases
Restrictie endonucleases (restrictie-enzymen) zijn Endo, DNA, ds en specifiek
Een Bacterie beschermt zichzelf tegen een virus door middel van restrictie-enzymen. Deze
restrictie-enzymen breken het DNA af dat het virus in de bacterie brengt. Maar hoe breekt
een bacterie zijn eigen DNA niet af? Een bacterie beschermt zijn eigen DNA door op de
restrictie sites een A of C te methyleren. Bv. Bacterie met enzym Dam = DNA adenine
methylase methyleert 5’-GATC-3’
Methyleren is een proces waarbij een methylgroep (Ch3-groep) aan een histon binnen het
DNA-molecuul wordt toegevoegd. Hierdoor verandert de structuur van het DNA dat
daardoor afleesbaar is tijdens de transcriptie.
Nucleases knippen tussen de deoxiribose en fosfaatgroep (verbreken fosfo-diester
verbinding) Fosfaat blijft achter op de 5’-kant van de fragmenten.
,De meeste restrictie-enzymen werken als homodimeer (twee identieke units) daarom
vertonen herkenningssites bijna altijd ‘omgekeerde symmetrie’ (van 5’ naar 3’ dezelfde
sequentie op beide strengen: palindroom)
Palindroom: zelfde sequentie op beide strengen, op zelfde plek geknipt door enzym.
Kortste notatie: G/GA. Makkelijk te herkennen op 1 streng: vanuit midden sequentie
complementair links tov rechts.
Bijvoorbeeld: BamH1: 5’-TGTAGGATCCAGGC-3‘
3’-ACATCCTAGGTCCG-5’
De meeste enzymen knippen binnen herkenningssequenties, sommige daarbuiten
Blunt knippen:
+
Sticky knippen:
(1e rij = 5’ overhang, 2e rij = 3’
overhang)
Annealing = fragmenten met een
compatible overhang kunnen met
elkaar verbonden worden
Knippen en plakken – gebruik restrictie-enzymen
1. Restriction enzyme cuts the sugar-phosphate backbones at each arrow
2. Base pairing of sticky ends produces various combinations
Fragments from different DNA molecule cut by the same restriction enzyme will be
used
3. DNA ligase seals the strands (ligase herstelt de DNA fosfodiester binding)
,Overhang? (5’/3’/blunt)
Welke uiteinden kunnen aan elkaar worden geligeerd?
1. G/GATCC 5’ met 3, evt met 7
2. C/CTAGG 5’ –
3. TC/GATCGA 5’ met 1, evt 7
4. TGATC/A 3’ –
5. CTCGA/G 3’ –
6. CTC/GAG Blunt met 8
7. A/GNNCT 5’ met 1 en 3, als NN=AT
8. TAA/TTA Blunt met 6
Transformatie met E.coli, vermenigvuldiging en DNA isolatie
Transformatie technieken
- Heat Shock
- Electroporatie
Vermenigvuldiging
Isolatie
- Fenol extractie
- Miniprep
1 - Verzwakken bacteriële celwand met lysozym en EDTA.
2 - Lyseren van cellen met SDS (detergens) en NaOH (pH 12)
3 - Precipitatie (chromosomale) eiwitten → plasmiden precipiteren niet.
4 - Neutraliseren van lysaat met kalium-acetaat.
5 - Plasmiden uit supernatant extraheren met fenol.
6 - Precipitatie met ijskoude ethanol of isopropanol (concentreert DNA en
verwijderd zouten).
DNA-zuivering met kolom: In plaats van het verwijderen van alle cel componenten, eiwitten
en RNA, wordt DNA selectief verwijderd.
Totaal RNA-isolatie: RNA wordt in principe op dezelfde manier geïsoleerd als DNA maar RNA
is zeer instabiel, RNase is zeer stabiel. Daarom:
- Onmiddellijk na isolatie (orgaan bv) snap freeze van samples in vloeibare stikstof.
- TRIZOL (Invitrogen) stabiliseert RNA tijdens homogenisatie.
- DEPC aan oplossingen toevoegen om RNase te inactiveren.
- RNase-vrije enzymen en oplossingen gebruiken.
- Handschoenen, labjassen.
- Homogeniseren/lyseren in aanwezigheid van RNase remmers (!)
- Opslaan in -80°C bij ethanol.
DNA verwijderen door Dnase behandeling
RNA Electroforese:
Een totaal RNA-monster bevat na isolatie alle soorten RNA, allen van verschillende lengten
smeer (allerlei banden op de gel)
Elektroforese RNA monster op denaturerende agarose gel (bv met formaldehyde)
secundaire structuren verdwijnen
Intact RNA twee duidelijke banden: 18s en 28s rRna (16s en 23s rRNA bij prokayoot)
rRNA ongeveer 80% van totaal, mRNA 1 tot 5 % van het totaal
, DNA agarose gel electroforese:
Scheiding op basis van: groot van het DNA-molecuul, kleine fragmenten lopen het snelst
Drijvende kracht: elektrische lading over gel
Lading DNA: negatief (DNA gaat dus naar de positieve kant)
Agarose gel concentratie agarose bepaald dichtheid.
Ethidiumbromide in gel fluoresceert na binding aan DNA.
Opbrengen in blauwe kleurstof: Broom fenol blauw loopt mee met DNA-fragmenten van 500
bp.
Gel op een UV bak:
Het Ethidium bromide dat tussen de basen hecht (intercalatie in dsDNA) maakt het DNA als
oranje bandjes zichtbaar.
Loading Buffer bevat oa:
- Glycerol/ficol: Hierdoor wordt het monster verzwaard, zodat het niet vermengd
wordt met de elektroforese buffer tijdens het opbrengen van het monster
- Broomfenol blauw: Front is zichtbaar en loopt op een 0,5-1,5% agarose gel, mee
met DNA-fragmenten ter grootte van ongeveer 500 bp.
- Orange G: Front is zichtbaar en loopt op een 0,5-1,5% agarose gel, mee met DNA-
fragmenten ter grootte van ongeveer 100 bp.
Geldichtheid: kies een geldichtheid (% agarose) die geschikt is voor scheiding van je DNA-
fragmenten. Laag % voor scheiding grote fragmenten, hoog %
voor scheiding kleine fragmenten.
DNA Markers: ‘ladder’ van DNA-fragmenten met bekende
grootte. Dit is voor het schatten van de grootte van het
onbekende fragment
De Pulse-field gel elektroforese wordt gebruikt voor zeer grote
fragmenten die niet te scheiden zijn met de standaard elektroforese.
Deze pulse-field gel elektroforese heeft afwisselende richtingen van
elektrisch veld waardoor de DNA-fragmenten zich telkens opnieuw
moeten richten (wat hen afremt). Fragmenten tot 2Mb kunnen hiermee
worden gescheiden.
Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) heeft een veel hogere dichtheid
dan agarose scheiding tot op 1 nucleotide nauwkeurig. Is ontwikkeld
voor het scheiden van eiwitten en gebeurd verticaal i.p.v horizontaal.
Kennis van het genoom (complete genetische samenstelling van een organisme, cel of virus):
- Isolatie:
- Manipulatie:
- Amplificatie: vermenigvuldigen van een stuk DNA
- Analyse:
Kloneren = het produceren van genetische identieke dieren, planten, cellen, bacteriën etc.
Veel voorkomende DNA-bewerkingen
- Copying:
- Cutting
- Rearranging
Amplificatie door bacteriën:
Bacteriën bevatten plasmiden die opengeknipt kunnen worden waarna er aan de sticky sides
een nieuw stukje DNA kan worden toegevoegd. Dit wordt dan weer teruggezet in de
bacterie waarna het zich gaat vermenigvuldigen met het nieuwe stukje DNA. Dit DNA wordt
dus ook weer doorgegeven aan de nieuwe bacteriën. Deze bacteriën kunnen bijvoorbeeld
weer worden gebruikt om olie op te ruimen na
een olieramp. Ook kunnen de de proteïnen
worden gebruikt om bijvoorbeeld een
groeifactor voor de mens te creëren.
Recombinant DNA technologie: natuurlijke
processen nabootsen in het lab om nieuwe
combinaties van DNA te creëren.
Enzymen Typen enzymen
Specifieke actie Nucleases (restrictie enzymen) – knippen
Voorspelbare actie Modificatoren – Bewerken
Controleerbaar Ligases – plakken
Makkelijk verkrijgbaar Plymerases - kopieren
Verschillende nucleases (enzymen die nucleïnezuren afbreken):
- Exo- en endo nucleases (exo knippen de zijkanten eraf, endo in het midden)
- DNA en RNA nucleases (RNA door de nucleasen Ribonucleasen en DNA door de
nucleasen Desoxyribonucleasen)
- Singlestrand en Dubbelstrand nucleases
- Specifiek en aspecifieke nucleases
Restrictie endonucleases (restrictie-enzymen) zijn Endo, DNA, ds en specifiek
Een Bacterie beschermt zichzelf tegen een virus door middel van restrictie-enzymen. Deze
restrictie-enzymen breken het DNA af dat het virus in de bacterie brengt. Maar hoe breekt
een bacterie zijn eigen DNA niet af? Een bacterie beschermt zijn eigen DNA door op de
restrictie sites een A of C te methyleren. Bv. Bacterie met enzym Dam = DNA adenine
methylase methyleert 5’-GATC-3’
Methyleren is een proces waarbij een methylgroep (Ch3-groep) aan een histon binnen het
DNA-molecuul wordt toegevoegd. Hierdoor verandert de structuur van het DNA dat
daardoor afleesbaar is tijdens de transcriptie.
Nucleases knippen tussen de deoxiribose en fosfaatgroep (verbreken fosfo-diester
verbinding) Fosfaat blijft achter op de 5’-kant van de fragmenten.
,De meeste restrictie-enzymen werken als homodimeer (twee identieke units) daarom
vertonen herkenningssites bijna altijd ‘omgekeerde symmetrie’ (van 5’ naar 3’ dezelfde
sequentie op beide strengen: palindroom)
Palindroom: zelfde sequentie op beide strengen, op zelfde plek geknipt door enzym.
Kortste notatie: G/GA. Makkelijk te herkennen op 1 streng: vanuit midden sequentie
complementair links tov rechts.
Bijvoorbeeld: BamH1: 5’-TGTAGGATCCAGGC-3‘
3’-ACATCCTAGGTCCG-5’
De meeste enzymen knippen binnen herkenningssequenties, sommige daarbuiten
Blunt knippen:
+
Sticky knippen:
(1e rij = 5’ overhang, 2e rij = 3’
overhang)
Annealing = fragmenten met een
compatible overhang kunnen met
elkaar verbonden worden
Knippen en plakken – gebruik restrictie-enzymen
1. Restriction enzyme cuts the sugar-phosphate backbones at each arrow
2. Base pairing of sticky ends produces various combinations
Fragments from different DNA molecule cut by the same restriction enzyme will be
used
3. DNA ligase seals the strands (ligase herstelt de DNA fosfodiester binding)
,Overhang? (5’/3’/blunt)
Welke uiteinden kunnen aan elkaar worden geligeerd?
1. G/GATCC 5’ met 3, evt met 7
2. C/CTAGG 5’ –
3. TC/GATCGA 5’ met 1, evt 7
4. TGATC/A 3’ –
5. CTCGA/G 3’ –
6. CTC/GAG Blunt met 8
7. A/GNNCT 5’ met 1 en 3, als NN=AT
8. TAA/TTA Blunt met 6
Transformatie met E.coli, vermenigvuldiging en DNA isolatie
Transformatie technieken
- Heat Shock
- Electroporatie
Vermenigvuldiging
Isolatie
- Fenol extractie
- Miniprep
1 - Verzwakken bacteriële celwand met lysozym en EDTA.
2 - Lyseren van cellen met SDS (detergens) en NaOH (pH 12)
3 - Precipitatie (chromosomale) eiwitten → plasmiden precipiteren niet.
4 - Neutraliseren van lysaat met kalium-acetaat.
5 - Plasmiden uit supernatant extraheren met fenol.
6 - Precipitatie met ijskoude ethanol of isopropanol (concentreert DNA en
verwijderd zouten).
DNA-zuivering met kolom: In plaats van het verwijderen van alle cel componenten, eiwitten
en RNA, wordt DNA selectief verwijderd.
Totaal RNA-isolatie: RNA wordt in principe op dezelfde manier geïsoleerd als DNA maar RNA
is zeer instabiel, RNase is zeer stabiel. Daarom:
- Onmiddellijk na isolatie (orgaan bv) snap freeze van samples in vloeibare stikstof.
- TRIZOL (Invitrogen) stabiliseert RNA tijdens homogenisatie.
- DEPC aan oplossingen toevoegen om RNase te inactiveren.
- RNase-vrije enzymen en oplossingen gebruiken.
- Handschoenen, labjassen.
- Homogeniseren/lyseren in aanwezigheid van RNase remmers (!)
- Opslaan in -80°C bij ethanol.
DNA verwijderen door Dnase behandeling
RNA Electroforese:
Een totaal RNA-monster bevat na isolatie alle soorten RNA, allen van verschillende lengten
smeer (allerlei banden op de gel)
Elektroforese RNA monster op denaturerende agarose gel (bv met formaldehyde)
secundaire structuren verdwijnen
Intact RNA twee duidelijke banden: 18s en 28s rRna (16s en 23s rRNA bij prokayoot)
rRNA ongeveer 80% van totaal, mRNA 1 tot 5 % van het totaal
, DNA agarose gel electroforese:
Scheiding op basis van: groot van het DNA-molecuul, kleine fragmenten lopen het snelst
Drijvende kracht: elektrische lading over gel
Lading DNA: negatief (DNA gaat dus naar de positieve kant)
Agarose gel concentratie agarose bepaald dichtheid.
Ethidiumbromide in gel fluoresceert na binding aan DNA.
Opbrengen in blauwe kleurstof: Broom fenol blauw loopt mee met DNA-fragmenten van 500
bp.
Gel op een UV bak:
Het Ethidium bromide dat tussen de basen hecht (intercalatie in dsDNA) maakt het DNA als
oranje bandjes zichtbaar.
Loading Buffer bevat oa:
- Glycerol/ficol: Hierdoor wordt het monster verzwaard, zodat het niet vermengd
wordt met de elektroforese buffer tijdens het opbrengen van het monster
- Broomfenol blauw: Front is zichtbaar en loopt op een 0,5-1,5% agarose gel, mee
met DNA-fragmenten ter grootte van ongeveer 500 bp.
- Orange G: Front is zichtbaar en loopt op een 0,5-1,5% agarose gel, mee met DNA-
fragmenten ter grootte van ongeveer 100 bp.
Geldichtheid: kies een geldichtheid (% agarose) die geschikt is voor scheiding van je DNA-
fragmenten. Laag % voor scheiding grote fragmenten, hoog %
voor scheiding kleine fragmenten.
DNA Markers: ‘ladder’ van DNA-fragmenten met bekende
grootte. Dit is voor het schatten van de grootte van het
onbekende fragment
De Pulse-field gel elektroforese wordt gebruikt voor zeer grote
fragmenten die niet te scheiden zijn met de standaard elektroforese.
Deze pulse-field gel elektroforese heeft afwisselende richtingen van
elektrisch veld waardoor de DNA-fragmenten zich telkens opnieuw
moeten richten (wat hen afremt). Fragmenten tot 2Mb kunnen hiermee
worden gescheiden.
Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) heeft een veel hogere dichtheid
dan agarose scheiding tot op 1 nucleotide nauwkeurig. Is ontwikkeld
voor het scheiden van eiwitten en gebeurd verticaal i.p.v horizontaal.
