Celbiologie 1: Claessens
DNA-replicatie
= kopiëren van het DNA
= semi-conservatief
DNA-polymerase
= enzym dat zelf DNA kan synthetiseren op basis van deoxyribonucleotiden =
het substraat
- Deoxyribonucleoside-monofosfaten moeten geactiveerd worden:
Op de 5’ uiteinden worden 2 fosfaatgroepen aangebracht door kinasen
Resultaat = deoxyribonucleoside-trifosfaten = dNTPs
DNA-polymerasen hebben een 3’ uiteinde nodig om te kunnen
polymeriseren => kunnen zelf geen replicatie starten
In 5’ naar 3’ richting => 5’ uiteinde van dNTP wordt verbonden met 3’
OH-groep van DNA
Tijdens de polymerisatie wordt pyryfosfaat afgesplitst + gehydrolyseerd
=> onomkeerbaar
De replicatievork
ORI = origin of replication = startplaats van de replicatie
DNA gaat uit elkaar en de synthese van de nieuwe strengen gebeurt
van links naar rechts
We krijgen 2 replicatievorken
1
,Enzymen nodig voor DNA-synthese:
1. Helicase: haalt de twee DNA strengen uit elkaar => gebruikt energie
van hydrolyse van ATP
2. Topoisomerase I en II: doordat tijdens de replicatie de strengen uit
elkaar gehaald worden ontstaat er een superwinding vlak voor de
replicatievork
Topoisomerase I: knipt één streng => de andere kan vrij ronddraaien
=> vervolgens wordt DNA-streng terug gesloten (energie komt van
superwinding zelf)
Topoisomerase II (superwindig introduceren): beide DNA strengen in 1
helix worden verbroken => een tweede helix wordt door deze winding
gehaald => geopende helix
wordt terug hersteld => ATP nodig
3. Single stranded binding protein (SSBP): beschermd het
enkelstrengig DNA tegen afbraak
4. Primase: dit is een RNA-polymerase => maakt korte RNA-fragmenten
aan die complementair zijn aan het enkelstrengig DNA = RNA primer
RNA primer => heeft 3’ OH uiteinde dat wordt herkend door DNA
polymerase => hecht hier nucleotiden aan vast
5. DNA-polymerase II: maakt nieuw DNA aan van 5’ richting naar 3’
6. Sliding clamp = PCNA: gaat DNA-polymerase vasthouden, zodat het
met het DNA geassocieerd blijft en er niet steeds opnieuw een DNA-
polymerase gerecruteerd moet worden => soort van schuifende klem
7. DNA-polymerase I: gaat RNA-primer vervangen door DNA =
exonuclease activiteit => in 5’ -3’ richting
8. DNA-ligase: gaat opening tussen kleine stukje dat RNA vervangt en
nieuw aangemaakt DNA = nick verbinden => ATP nodig
Opm.: 3’-5’ exonuclease acitiveit => gaat DNA streng die net is aangemaakt
terug verwijderen => zeer belangrijk in het proofreading proces
Door het inbouwen van een fout nucleotide ontstaat er een verwrongen
helix => foute nucleotide zit in het exonuclease centrum ipv van in
polymerase site
De replicatievork is asymmetrisch:
DNA-polymerase kan maar in 1 richting werken => van 5’ naar 3’
- Leading strand: bij deze streng gebeurt de DNA-replicatie volledig
processief
Primase moet maar 1 keer een primer aanmaken
2
, - Lagging strand: de streng wordt vrijgemaakt in de tegenovergestelde
richting van de DNA-synthese
Primase moet steeds een nieuwe RNA primer maken waarop DNA
polymerase III kan plaatsvinden
Gevolg: steeds DNA fragmenten met ongeveer 1000 baseparen met op
het einde een RNA fragment = Okazaki fragmenten => worden
verwijderd door DNA polymerasen I of herstel-polymerase
Replicatiestart
= moet strikt gecontroleerd worden om te voorkomen dat sommige delen niet
meerdere keren voorkomen => controle ter hoogte van de ORI’s
Replicatiestart bij prokaryoten
ORI’svan bacteriën:
- 250 baseparen lang
- A/T rijk + bevatten herhalingen van 3x13 of 4x9 baseparenlang
- Circulair DNA => 1 ORI => enzymen van replicatievork kunnen op de twee
strengen in de twee richtingen werken
- 3 eiwitten zijn hierbij betrokken: DnaA, DnaB en DnaC
1. DnaA bindt aan 9-mers => complexeren tot er ongeveer 40 aanwezig
zijn
2. DnaA => enorme torsie => 13-mers gaan denatureren
3. DnaC (helicase inhibitor) gaan DnaB (helicase) eiwitten afzetten
4. 6 DnaB eiwitten vormen ringstructuur => helicase-activiteit => schuift
als ring over DNA + haalt deze uit elkaar => energie in vorm van ATP
wordt verbruikt
Replicatiestart bij eukaryoten
ORI’s van eukaryoten:
- A/T rijk + ATP nodig om DNA helix te smelten
- DNA replicatie initieert 1 keer per ORI, per celcyclus
ORC = Origin Recognition Complex => eiwitcomplex dat op elke ORI zit
gedurende de hele celcyclus
- Herkent specifieke sequenties ter hoogte van de ORI’s
1. Cdc6 = cel division cycle => associeert met ORC tijdens vroege G1 fase
Helpt de vorming van helicase ringen => vorming van pre-replicatie-
complex
2. S-fase specifiek cycline-dependent kinase (cdk) => activeert
replicatie start => de verschillende enzymen van de replicatiestart worden
op de replicatievork gezet
3. Hetzelfde Cdk verhindert re-replicatiestart door het veroorzaken van
dissociatie van cdc6 van ORC (door fosforylatie)
Gefoforyleerde helicase wordt uit de kern gepompt + snel afgebroken
3
, 4. Einde van de mitose: cdk activiteit wordt stopgezet => cdc6 en helicase
worden niet meer gefosforyleerd en kunnen tijdens vroege G1-fase terug
naar ORI/ORC migreren + deze activeren
Terminatie van de replicatie
Prokaryoten
Prokaryoten hebben een circulair DNA en maar 1 ORI => op het einde van de
replicatie lopen de twee replicatievorken in elkaar over => 2 DNA cirkels
ontstaan
Twee dochterchromosomen worden tijdens de replicatie vastgehecht
aan de celwand
Tijdens celdeling (na replicatie) => aanhechtingspunten komen elk
terecht in 1 dochtercel
Eukaryoten: het telomerase
Eukaryote chromosomen => lineaire elementen => twee uiteinden
- Leading strand: op het einde van de replicatie zal de ‘replicatie-
machinery’ komt los van dubbelstrengig DNA
- Lagging strand: er moet continu een RNA primer worden aangemaakt
door het primase
Uiteinde van deze strand kan niet worden aangemaakt want RNA
primer kan zich nergens aan vasthechten of RNA primer kan niet
vervangen worden door DNA => het DNA eindigt met een enkelstrengig
stukje
Probleem: enkelstrengig stukje gaat tijdens de volgende replicatie
verloren + aanhechtingspunt voor DNasen => breken DNA af
Of worden herkend door enzymen die fouten herstellen maar dat is hier
niet van toepassing
Op elk uiteinde van een chromosoom => telomeer = herhalingen van
korte sequenties
Telomerasen zijn enkel actief in voortplantingscellen, stamcellen en
kankercellen => tijdens replicatie van lichaamscellen gaat er telkens
een stukje verloren
1. Zorgt dat er geen informatie verloren gaat tijdens de replicatie
Enzym telomerase (reverse trancriptase) kan deze korte DNA-
fragmenten aanmaken, gebruikmakende van een template die hij
zelf bezit, in de vorm van een RNA-keten
Het telomerase grijpt plaats aan het 3’ OH uiteinde + verlengt het
=> dit proces herhaalt zich => aan het einde van elke chromosoom
=> repetitieve sequenties
Resultaat: er is een langer enkelstrengig DNA stuk voorhanden =>
primase kan wel plaatsgrijpen
2. Beschermen van de chromosoomuiteinden: tijdens interfase
heeft chromosoom nog een stukje 3’OH uiteinde => gaat in dubbele
DNA streng binnendringen en een triple helix vormen => lasso- of
loop-structuur => enkelstrengig DNA is beschermd
4
DNA-replicatie
= kopiëren van het DNA
= semi-conservatief
DNA-polymerase
= enzym dat zelf DNA kan synthetiseren op basis van deoxyribonucleotiden =
het substraat
- Deoxyribonucleoside-monofosfaten moeten geactiveerd worden:
Op de 5’ uiteinden worden 2 fosfaatgroepen aangebracht door kinasen
Resultaat = deoxyribonucleoside-trifosfaten = dNTPs
DNA-polymerasen hebben een 3’ uiteinde nodig om te kunnen
polymeriseren => kunnen zelf geen replicatie starten
In 5’ naar 3’ richting => 5’ uiteinde van dNTP wordt verbonden met 3’
OH-groep van DNA
Tijdens de polymerisatie wordt pyryfosfaat afgesplitst + gehydrolyseerd
=> onomkeerbaar
De replicatievork
ORI = origin of replication = startplaats van de replicatie
DNA gaat uit elkaar en de synthese van de nieuwe strengen gebeurt
van links naar rechts
We krijgen 2 replicatievorken
1
,Enzymen nodig voor DNA-synthese:
1. Helicase: haalt de twee DNA strengen uit elkaar => gebruikt energie
van hydrolyse van ATP
2. Topoisomerase I en II: doordat tijdens de replicatie de strengen uit
elkaar gehaald worden ontstaat er een superwinding vlak voor de
replicatievork
Topoisomerase I: knipt één streng => de andere kan vrij ronddraaien
=> vervolgens wordt DNA-streng terug gesloten (energie komt van
superwinding zelf)
Topoisomerase II (superwindig introduceren): beide DNA strengen in 1
helix worden verbroken => een tweede helix wordt door deze winding
gehaald => geopende helix
wordt terug hersteld => ATP nodig
3. Single stranded binding protein (SSBP): beschermd het
enkelstrengig DNA tegen afbraak
4. Primase: dit is een RNA-polymerase => maakt korte RNA-fragmenten
aan die complementair zijn aan het enkelstrengig DNA = RNA primer
RNA primer => heeft 3’ OH uiteinde dat wordt herkend door DNA
polymerase => hecht hier nucleotiden aan vast
5. DNA-polymerase II: maakt nieuw DNA aan van 5’ richting naar 3’
6. Sliding clamp = PCNA: gaat DNA-polymerase vasthouden, zodat het
met het DNA geassocieerd blijft en er niet steeds opnieuw een DNA-
polymerase gerecruteerd moet worden => soort van schuifende klem
7. DNA-polymerase I: gaat RNA-primer vervangen door DNA =
exonuclease activiteit => in 5’ -3’ richting
8. DNA-ligase: gaat opening tussen kleine stukje dat RNA vervangt en
nieuw aangemaakt DNA = nick verbinden => ATP nodig
Opm.: 3’-5’ exonuclease acitiveit => gaat DNA streng die net is aangemaakt
terug verwijderen => zeer belangrijk in het proofreading proces
Door het inbouwen van een fout nucleotide ontstaat er een verwrongen
helix => foute nucleotide zit in het exonuclease centrum ipv van in
polymerase site
De replicatievork is asymmetrisch:
DNA-polymerase kan maar in 1 richting werken => van 5’ naar 3’
- Leading strand: bij deze streng gebeurt de DNA-replicatie volledig
processief
Primase moet maar 1 keer een primer aanmaken
2
, - Lagging strand: de streng wordt vrijgemaakt in de tegenovergestelde
richting van de DNA-synthese
Primase moet steeds een nieuwe RNA primer maken waarop DNA
polymerase III kan plaatsvinden
Gevolg: steeds DNA fragmenten met ongeveer 1000 baseparen met op
het einde een RNA fragment = Okazaki fragmenten => worden
verwijderd door DNA polymerasen I of herstel-polymerase
Replicatiestart
= moet strikt gecontroleerd worden om te voorkomen dat sommige delen niet
meerdere keren voorkomen => controle ter hoogte van de ORI’s
Replicatiestart bij prokaryoten
ORI’svan bacteriën:
- 250 baseparen lang
- A/T rijk + bevatten herhalingen van 3x13 of 4x9 baseparenlang
- Circulair DNA => 1 ORI => enzymen van replicatievork kunnen op de twee
strengen in de twee richtingen werken
- 3 eiwitten zijn hierbij betrokken: DnaA, DnaB en DnaC
1. DnaA bindt aan 9-mers => complexeren tot er ongeveer 40 aanwezig
zijn
2. DnaA => enorme torsie => 13-mers gaan denatureren
3. DnaC (helicase inhibitor) gaan DnaB (helicase) eiwitten afzetten
4. 6 DnaB eiwitten vormen ringstructuur => helicase-activiteit => schuift
als ring over DNA + haalt deze uit elkaar => energie in vorm van ATP
wordt verbruikt
Replicatiestart bij eukaryoten
ORI’s van eukaryoten:
- A/T rijk + ATP nodig om DNA helix te smelten
- DNA replicatie initieert 1 keer per ORI, per celcyclus
ORC = Origin Recognition Complex => eiwitcomplex dat op elke ORI zit
gedurende de hele celcyclus
- Herkent specifieke sequenties ter hoogte van de ORI’s
1. Cdc6 = cel division cycle => associeert met ORC tijdens vroege G1 fase
Helpt de vorming van helicase ringen => vorming van pre-replicatie-
complex
2. S-fase specifiek cycline-dependent kinase (cdk) => activeert
replicatie start => de verschillende enzymen van de replicatiestart worden
op de replicatievork gezet
3. Hetzelfde Cdk verhindert re-replicatiestart door het veroorzaken van
dissociatie van cdc6 van ORC (door fosforylatie)
Gefoforyleerde helicase wordt uit de kern gepompt + snel afgebroken
3
, 4. Einde van de mitose: cdk activiteit wordt stopgezet => cdc6 en helicase
worden niet meer gefosforyleerd en kunnen tijdens vroege G1-fase terug
naar ORI/ORC migreren + deze activeren
Terminatie van de replicatie
Prokaryoten
Prokaryoten hebben een circulair DNA en maar 1 ORI => op het einde van de
replicatie lopen de twee replicatievorken in elkaar over => 2 DNA cirkels
ontstaan
Twee dochterchromosomen worden tijdens de replicatie vastgehecht
aan de celwand
Tijdens celdeling (na replicatie) => aanhechtingspunten komen elk
terecht in 1 dochtercel
Eukaryoten: het telomerase
Eukaryote chromosomen => lineaire elementen => twee uiteinden
- Leading strand: op het einde van de replicatie zal de ‘replicatie-
machinery’ komt los van dubbelstrengig DNA
- Lagging strand: er moet continu een RNA primer worden aangemaakt
door het primase
Uiteinde van deze strand kan niet worden aangemaakt want RNA
primer kan zich nergens aan vasthechten of RNA primer kan niet
vervangen worden door DNA => het DNA eindigt met een enkelstrengig
stukje
Probleem: enkelstrengig stukje gaat tijdens de volgende replicatie
verloren + aanhechtingspunt voor DNasen => breken DNA af
Of worden herkend door enzymen die fouten herstellen maar dat is hier
niet van toepassing
Op elk uiteinde van een chromosoom => telomeer = herhalingen van
korte sequenties
Telomerasen zijn enkel actief in voortplantingscellen, stamcellen en
kankercellen => tijdens replicatie van lichaamscellen gaat er telkens
een stukje verloren
1. Zorgt dat er geen informatie verloren gaat tijdens de replicatie
Enzym telomerase (reverse trancriptase) kan deze korte DNA-
fragmenten aanmaken, gebruikmakende van een template die hij
zelf bezit, in de vorm van een RNA-keten
Het telomerase grijpt plaats aan het 3’ OH uiteinde + verlengt het
=> dit proces herhaalt zich => aan het einde van elke chromosoom
=> repetitieve sequenties
Resultaat: er is een langer enkelstrengig DNA stuk voorhanden =>
primase kan wel plaatsgrijpen
2. Beschermen van de chromosoomuiteinden: tijdens interfase
heeft chromosoom nog een stukje 3’OH uiteinde => gaat in dubbele
DNA streng binnendringen en een triple helix vormen => lasso- of
loop-structuur => enkelstrengig DNA is beschermd
4
