1. CHROMATOGRAFISCHE BEGRIPPEN
DOEL = Scheiden van verbindingen
C bepalen → kwantitatief
Identificatie → kwalita ef
SOORTEN chromatografie
1. VERDELINGSCHROMATOGRAFIE → scheiding o.b.v. oplosbaarheid
2. ADSORPTIECHROMATOGRAFIE → scheiding o.b.v. polariteit
3. GELFILTRATIE (verzadigde Sephadex-bolletjes) → scheiding o.b.v. groo e moleculen
DUNNE LAAG- EN PAPIERCHROMATOGRAFIE → scheiding o.b.v. polariteit
Dunne laag Verdeling tussen het aan cellulose
absorbens op glasplaat gebonden water en MF
bv. silicagel (polair)
!! CONDITIONEREN
RF-WAARDE
RETENTIETIJDEN
1. DODE TIJD (t0 of tA)
2. TOTALE RETENTIETIJD (tR)
3. GECORRIGEERDE RETENTIETIJD/ NETTO RETENTIETIJD (t’R)
Factoren die retentie beïnvloeden
1. Verdelingscoëfficiënt K (evenwicht)
2. Verdelingsverhouding k / capaciteitsfactor/ capaciteitsverhouding (kwantitatieve verdeling)
1
, INWENDIGE STANDAARD
Relatieve piekoppervlak = Piekopp. component
Piekopp. inwendige standaard
Identificatie stoffen
Nut Injectievolumes
Onnauwkeurigheden corrigeren Matrixeffect
Kenmerken
1. Stabiel & zuiver + niet voorkomen in originele monster
2. Duidelijke piek
3. Parameters van invloed op de detectie van de gebruikte methode moeten voor IS ca. gelijk
zijn als analiet
4. Concentratie ca. gelijk als analiet
5. Gelijkt qua structuur op de te onderzoeken component (stoffen niet ver uit elkaar elueren →
kortere analysetijd)
6. Mag niet interfereren met analiet
Selectiviteit/ solventefficiëntie Kolomefficiëntie
Streven naar pieken die basislijn gescheiden zijn Streven naar scherpe, smalle pieken
Keuze SF, MF en T Capaciteit van de kolom om nauwe pieken te
produceren
Wordt bepaald door:
1. Schotelgetal (N)
Meer N → smallere piek → betere scheiding
RRT↑ → betere scheiding (piekmax verder uit elkaar)
Meer van 1 afwijkt → betere scheiding Piekbreedte ~ N
2. Theoretische plaathoogte (HETP/H)
Concentratiebepaling
1. Identificatie → RRT vergelijken met standaard
2. Kwantificatie → hoeveelheid bepalen a.d.h.v.
relatieve piekoppervlakte H↓ → N↑ → smallere piek → betere scheiding
Schotelhoogtevergelijking (Van Deemter)
(Factoren die H beïnvloeden)
i.f.v. draaggassnelheid → bepalen ideale
gasflow
Resolutie
>1,5 → overlap <1% van de piekoppervlak → basislijnresolu e/ basislijnscheiding
>1,7 → minimaliseert kans dat methode in gedrang komt door minieme variaties in scheidingscondities
2
, 2. VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE
SF - Kenmerken:
DOEL: te scheiden mengsel in eluensstroom brengen zonder - Rechte roestvrije stalen buis (pakking)
debietonderbreking - 5 – 30 cm
- Diameter 2,3 – 5 mm
LOAD → capilaire monsterlust (enkele µl) wordt gevuld ! CONDITIONEREN
INJECT → monster wordt naar kolom geleid door injec espuit 1. REVERSED PHASE CHROMATOGRAFIE/ HPLC
SF: apolaire (zwak polaire R-groep), MF: meer polair
Reproduceerbaarheid
2. NORMAL PHASE CHROMATOGRAFIE/ HPLC
SF: polaire R-groep, MF: meer apolair
ISOCRATISCHE ELUTIE vs. GRADIËNTELUTIE (MF)
Op eind aanzuigleiding
- Porositeit 5 µm
- Stofdeeltjes
tegenhouden
- Pompkleppen
beschermen
Vloeistof voor MF
1. Constant mogelijk pulsvrij debiet (10 µl –
- Gepaste verhouding
10ml/min)
- Verschillende soorten →
→ 2 alternerende plunjerkoppen (ene stuurt
polariteit? UV-detector → registreerd absorbanties i.f.v. de tijd
MF naar kolom, ene zuigt MF aan)
- ! Geen lucht Doorstroomcel = microcuvet, inhoud 10 µl en weglengte 5 – 10 nm
2. Hoge drukken vereist om grote weerstand
ISOCRATISCHE ELUTIE vs. tegen VS-stroming te overwinnen 2 Types:
GRADIËNTELUTIE → max. druk 40 mPa (400 bar) (afh. kolom) 1. Vaste golflengtedetector
Bij opstart: PURGEREN 2. Variabele golflengtedetector (deuteriumlamp)
3
DOEL = Scheiden van verbindingen
C bepalen → kwantitatief
Identificatie → kwalita ef
SOORTEN chromatografie
1. VERDELINGSCHROMATOGRAFIE → scheiding o.b.v. oplosbaarheid
2. ADSORPTIECHROMATOGRAFIE → scheiding o.b.v. polariteit
3. GELFILTRATIE (verzadigde Sephadex-bolletjes) → scheiding o.b.v. groo e moleculen
DUNNE LAAG- EN PAPIERCHROMATOGRAFIE → scheiding o.b.v. polariteit
Dunne laag Verdeling tussen het aan cellulose
absorbens op glasplaat gebonden water en MF
bv. silicagel (polair)
!! CONDITIONEREN
RF-WAARDE
RETENTIETIJDEN
1. DODE TIJD (t0 of tA)
2. TOTALE RETENTIETIJD (tR)
3. GECORRIGEERDE RETENTIETIJD/ NETTO RETENTIETIJD (t’R)
Factoren die retentie beïnvloeden
1. Verdelingscoëfficiënt K (evenwicht)
2. Verdelingsverhouding k / capaciteitsfactor/ capaciteitsverhouding (kwantitatieve verdeling)
1
, INWENDIGE STANDAARD
Relatieve piekoppervlak = Piekopp. component
Piekopp. inwendige standaard
Identificatie stoffen
Nut Injectievolumes
Onnauwkeurigheden corrigeren Matrixeffect
Kenmerken
1. Stabiel & zuiver + niet voorkomen in originele monster
2. Duidelijke piek
3. Parameters van invloed op de detectie van de gebruikte methode moeten voor IS ca. gelijk
zijn als analiet
4. Concentratie ca. gelijk als analiet
5. Gelijkt qua structuur op de te onderzoeken component (stoffen niet ver uit elkaar elueren →
kortere analysetijd)
6. Mag niet interfereren met analiet
Selectiviteit/ solventefficiëntie Kolomefficiëntie
Streven naar pieken die basislijn gescheiden zijn Streven naar scherpe, smalle pieken
Keuze SF, MF en T Capaciteit van de kolom om nauwe pieken te
produceren
Wordt bepaald door:
1. Schotelgetal (N)
Meer N → smallere piek → betere scheiding
RRT↑ → betere scheiding (piekmax verder uit elkaar)
Meer van 1 afwijkt → betere scheiding Piekbreedte ~ N
2. Theoretische plaathoogte (HETP/H)
Concentratiebepaling
1. Identificatie → RRT vergelijken met standaard
2. Kwantificatie → hoeveelheid bepalen a.d.h.v.
relatieve piekoppervlakte H↓ → N↑ → smallere piek → betere scheiding
Schotelhoogtevergelijking (Van Deemter)
(Factoren die H beïnvloeden)
i.f.v. draaggassnelheid → bepalen ideale
gasflow
Resolutie
>1,5 → overlap <1% van de piekoppervlak → basislijnresolu e/ basislijnscheiding
>1,7 → minimaliseert kans dat methode in gedrang komt door minieme variaties in scheidingscondities
2
, 2. VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE
SF - Kenmerken:
DOEL: te scheiden mengsel in eluensstroom brengen zonder - Rechte roestvrije stalen buis (pakking)
debietonderbreking - 5 – 30 cm
- Diameter 2,3 – 5 mm
LOAD → capilaire monsterlust (enkele µl) wordt gevuld ! CONDITIONEREN
INJECT → monster wordt naar kolom geleid door injec espuit 1. REVERSED PHASE CHROMATOGRAFIE/ HPLC
SF: apolaire (zwak polaire R-groep), MF: meer polair
Reproduceerbaarheid
2. NORMAL PHASE CHROMATOGRAFIE/ HPLC
SF: polaire R-groep, MF: meer apolair
ISOCRATISCHE ELUTIE vs. GRADIËNTELUTIE (MF)
Op eind aanzuigleiding
- Porositeit 5 µm
- Stofdeeltjes
tegenhouden
- Pompkleppen
beschermen
Vloeistof voor MF
1. Constant mogelijk pulsvrij debiet (10 µl –
- Gepaste verhouding
10ml/min)
- Verschillende soorten →
→ 2 alternerende plunjerkoppen (ene stuurt
polariteit? UV-detector → registreerd absorbanties i.f.v. de tijd
MF naar kolom, ene zuigt MF aan)
- ! Geen lucht Doorstroomcel = microcuvet, inhoud 10 µl en weglengte 5 – 10 nm
2. Hoge drukken vereist om grote weerstand
ISOCRATISCHE ELUTIE vs. tegen VS-stroming te overwinnen 2 Types:
GRADIËNTELUTIE → max. druk 40 mPa (400 bar) (afh. kolom) 1. Vaste golflengtedetector
Bij opstart: PURGEREN 2. Variabele golflengtedetector (deuteriumlamp)
3
