EXAMENVRAGEN LES 2
C+D Niet GoI: dit wil je klonen (pUC vector)
GC content: 30-70%
Tm = 50-60°C
Geen P-P bindingen
Geen gebonden 3’-uiteinde = vrij: ongewoon dat polymerase bindt en verlengt.
△G > -5kDa = goed
Mutatie aan 5’ prime end: ver van 3’end geen duplex storingen.
, 5’ GAA GTA TCG … TGT ACG CTA 3’
3’ CTT CAT AGC … ACA TGC GAT 5’
GG: steek in primer BsaI-site
= volledige controle over die site want bevindt zich in de primer.
= volledige controle over overhangs
-> klonen.
DNA assemblage: space = complementair -> binden -> assembleer DNA.
- ≠ nulecotiden = ≠ overhang : controle.
- Controle over overhangs -> controle over assembleren van DNA.
(overhangs = programmeerbaar: gepland dan kan je het klonen).
, F Q
Taq = 5’ -> 3’ exonuclease
- Primers zijn niet vertekend (bias)
- GC content
- Tm (lengte primer)
- Probe-primer interacties
- Probe positie moet tussen de 2 primers zijn
- △G
- Specifieke annealing temperatuur.
, 1e getekende figuur = GGC: klonen met type IIs endonuclease om DNA te knippen,
herkenningssite is niet palindromisch en enzymen knippen buiten herkenningssite.
Je kan vreemd DNA introduceren door te knippen met hetzelfde enzym en ligeren in de
vector.
De overhangen zijn gekozen, omdat ze compatibel moeten zijn om aan elkaar vast te hagen
(ligate).
+ knippen buiten herkenningsplaats, wanneer ze ligeren willen ze de herkenningsplaats niet
regenereren -> SCARLESS klonen: vector kan in 1 stap gedaan worden
2e getekende figuur BB: bestaat uit BB-delen = promotor, RBS, knip sequenties en terminators
deze behoren tot de restrictie enzym assembleer standaard, deze laat toe om specifieke
restrictie enzymen te gebruiken om te knippen en dan plakken van de individuele delen tot
een samengesteld deel. Herkenningsplaats kan geregenereerd worden dus een nieuwe
restrictie kan plaatsvinden. Door herhaling -> bouwen van een geheel systeem van
individuele blokken.
+ klassieke afhankelijk van identificeren van specifieke endonucleasen sites = case-by-case.
+ BB: gestandaardiseerd, modulair, robuust en herhaalbaar -> betrouwbaar.
C+D Niet GoI: dit wil je klonen (pUC vector)
GC content: 30-70%
Tm = 50-60°C
Geen P-P bindingen
Geen gebonden 3’-uiteinde = vrij: ongewoon dat polymerase bindt en verlengt.
△G > -5kDa = goed
Mutatie aan 5’ prime end: ver van 3’end geen duplex storingen.
, 5’ GAA GTA TCG … TGT ACG CTA 3’
3’ CTT CAT AGC … ACA TGC GAT 5’
GG: steek in primer BsaI-site
= volledige controle over die site want bevindt zich in de primer.
= volledige controle over overhangs
-> klonen.
DNA assemblage: space = complementair -> binden -> assembleer DNA.
- ≠ nulecotiden = ≠ overhang : controle.
- Controle over overhangs -> controle over assembleren van DNA.
(overhangs = programmeerbaar: gepland dan kan je het klonen).
, F Q
Taq = 5’ -> 3’ exonuclease
- Primers zijn niet vertekend (bias)
- GC content
- Tm (lengte primer)
- Probe-primer interacties
- Probe positie moet tussen de 2 primers zijn
- △G
- Specifieke annealing temperatuur.
, 1e getekende figuur = GGC: klonen met type IIs endonuclease om DNA te knippen,
herkenningssite is niet palindromisch en enzymen knippen buiten herkenningssite.
Je kan vreemd DNA introduceren door te knippen met hetzelfde enzym en ligeren in de
vector.
De overhangen zijn gekozen, omdat ze compatibel moeten zijn om aan elkaar vast te hagen
(ligate).
+ knippen buiten herkenningsplaats, wanneer ze ligeren willen ze de herkenningsplaats niet
regenereren -> SCARLESS klonen: vector kan in 1 stap gedaan worden
2e getekende figuur BB: bestaat uit BB-delen = promotor, RBS, knip sequenties en terminators
deze behoren tot de restrictie enzym assembleer standaard, deze laat toe om specifieke
restrictie enzymen te gebruiken om te knippen en dan plakken van de individuele delen tot
een samengesteld deel. Herkenningsplaats kan geregenereerd worden dus een nieuwe
restrictie kan plaatsvinden. Door herhaling -> bouwen van een geheel systeem van
individuele blokken.
+ klassieke afhankelijk van identificeren van specifieke endonucleasen sites = case-by-case.
+ BB: gestandaardiseerd, modulair, robuust en herhaalbaar -> betrouwbaar.
