1 scheidingstechnieken
1.1 Inleiding
Twee methoden om interferendere substanties uit te schakelen
Het immobiliseren van de interferentie. Door het toevoegen van een reagens dat de
interferentie uitschakelt zonder met de onbekende te reageren = maskeren
Fysische scheiding van de interferentie. Filtratie, destillatie
en, extractie en chromatografie
We streven naar snelle scheiding en analyse
Scherpe scheiding en nauwkeurige analyse
Aantonen en bepalen micro en ultramicrohoeveelheden
Automatisering
Mengsel verdeelt zich over twee fasen die daarna van elkaar gescheiden worden. De scheiding zal
efficiënter zijn als:
er een evenwichtsinstelling gebeurt
het aantal evenwichtsinstellingen groter is.
Snellere retentietijd zorgt voor meer evenwichten omdat ze beter met elkaar kunnen reageren. Zet dus
niet te veel druk op kolom. Voldoende tijd geven om evenwicht te creeren.
Verdeling coëfficiënt=K = manier waarop een bepaalde component zich verdeeld over 2 fasen.
Men moet overstappen naar fractioneringstechnieken, dus eigenlijk verdeling tussen twee fasen maar
vele malen achter elkaar.
De recovery van de onbekende moet zo volledig mogelijk zijn
P2-3 afleiding kennen
1.2 Extractie
Scheiding op basis van het verschil in oplosbaarheid van de bestanddelen in twee niet mengbare fasen.
Dit gebeurt met organische lagen.
K = [Aorg] / [Awater]
Grotere K dan kruipt stof beter/liever in bovenste laag, organische laag
P4 afleiding kennen
Een extractie zal meer efficiënt verlopen met kleine volumes organische fase ipv met 1 groter volume
Zelf kunnen berekenen, gwn formule toepassen p 4
De stof X is kwantitatief gescheiden als 99% ervan geëxtraheerd is
De verhouding Kx en Ky wordt de scheidingsfactor genoemd. Om in 1 enkele extractie kwantitatief te
scheiden moet Kx ongeveer 10000 maal groter zijn dan Ky
1
,Automatische extractie apparaten werken met het principe van de tegenstroomverdeling of counter
current distribution (CCD)
P7 kennen/kunnen binonium van Newton, grafieken p 8.,9 kunnen maken en berekenen
Hoe groter de K waarde, hoe sneller de component in de bovenfase komt, hoe beter de scheiding
CCD vooral voor nucleïnezuren, eiwitten, vitamine en antibiotica
1.3 Destillatie en HETP
Hoogte equivalent theoretische plaat: hoogte tussen 2 theoretische platen
Meervoudige destillatie is met rectificeerkolom tussen kolf en condensor
Tijdens destillatie is dit oppervlakte om af te koelen en zorgt voor betere scheiding, meer oppervlakte is
beter.
Schotels/platen, op elke schotel gebeurt er een uitwisselingsproces, dus hoe meer hoe beter door meer
uitwisselingsprocessen en beter evenwicht.
Als we de lengte van de kolom delen door het aantal schotels, kleiner getal zijn meer platen, hoe meer
evenwichten.
Bij te lange kolom wordt de totale hoeveelheid vloeistof op de schotels, de ‘hold-up’ aanzienlijk groter.
Dit mag niet meer dan 10% van de te destilleren hoeveelheid bedragen, max 100 schotels.
In chromatografie en ion uitwisseling wordt door het continue verloop, dit evenwicht nooit bereikt. Deze
hebben wel veeeel meer schotels.
Hoe kleiner de HETP, hoe groter het aantal platen per eenheid kolomlengte, dus hoe beter de scheiding.
1.4 Chromatografie
Dit is alles van scheidingstechnieken waar de bestandsdelen zich herhaaldelijk verdelen over 2 fasen.
Ingewikkeld mengsel kan gescheiden worden in zijn verschillende bestanddelen, deze kunnen geïsoleerd
en geïdentificeerd worden. Mengsel wordt aangebracht op een poreuze stationaire fase(blijft in kolom
zitten) en meegenomen door mobiele fase(loopt door kolom).
Mobiele fase loopt over stationaire fase volgens de zwaartekracht (kolomch), pompen(HPLC) of capillaire
werking(papierch).
Verdeling gebeurt op basis van affiniteit voor het eluens en stationaire fase. (scheiding hangt af van hoe
graag ze in elke fase zit) (K = conc stationaire fase / conc mobiele fase)
affiniteit voor eluens wordt bepaald door de oplosbaarheid in eluens of vluchtigheid van component.
affiniteit voor stationaire fase wordt bepaald door adsorpitevermogen van de vase stof of door de
oplosbaarheid als stat vloeistof is.
Stationaire fase vast = adsorptie
stationaire fase vloeistof = verdelingschromatografie
Voordelen:
Zeer specifiek, mengsel met veel comp kan snel gescheiden worden
Groot aanpassingsvermogen, scheiding kan veranderd worden door vers factors, parameters…
voornamelijk temperatuur en eluens veranderen zijn goede aanpassingsfactors
2
, Zeer algemeen karakter
Zeer grote gevoeligheid
K=[Astationaire] / [Amobiele]` hoe groter K hoe langer het duurt voor hij uit kolom komt
K is constant bij een bepaalde temperatuur zolang concentraties van stoffen niet te groot zijn. Lineaire
chromatografie.
Continue toevoegen van mobiele fase geeft dus een continue wisselwerking tussen de twee fasen met
als eindresultaat: scheiding van de bestanddelen over de kolom.
Elutie: het uitwassen van de bestanddelen uit de kolom door het toevoegen van een overmaat nieuw
solvent(eluens)
Chromatogram is detector response ifv tijd (of volume)
Plaats van piek geeft informatie over welk bestandsdeel aanwezig is. De oppervlakte zegt iets over de
concentratie.
Dode tijd, dood volume: tijd dat het solvent nodig heeft om door de kolom te elueren. Iets dat geen
affiniteit vertoont met de stationaire fase. Als stationaire fase polair is dan iets apolair toevoegen om
dode tijd te bepalen.
1.5 Chromatografische parameters
Kolom moet lang genoeg zijn om voldoende scheiding te verkrijgen, maar mag ook niet te lang zijn
omdat er dan zoneverbreding oploopt.
Parameters om efficiënte scheiding te doorgaan
1.5.1 Aantal theoretische platen (N)
Kolom bestaat uit smalle aaneengrenzende lagen(platen) zoals schotels bij destillatie. Op elke plaat
neemt men aan dat er evenwicht plaatsgrijpt van de beschouwde stof tussen stationaire en mobiele
fase. Dit is een opeenvolging van transfers omdat dit continue gebeurt.
Efficiëntie stijgt als aantal evenwichten stijgt dus als aantal platen stijgt.
1.5.2 HETP (H)
Hoeveel platen er voor een bepaalde kolomlengte worden gehaald is interessanter.
N = L/H
L = lengte van kolompakking
H = standaardeviatie2 / L
Efficiëntie wordt groter als H kleiner wordt of N groter wordt
1.5.3 Retentietijd
Hoe groter het verschil in retentietijden hoe beter de scheiding
1.5.4 Resolutie
Pieken moeten zo smal mogelijk zijn, resolutie R = scheidend vermogen
3
1.1 Inleiding
Twee methoden om interferendere substanties uit te schakelen
Het immobiliseren van de interferentie. Door het toevoegen van een reagens dat de
interferentie uitschakelt zonder met de onbekende te reageren = maskeren
Fysische scheiding van de interferentie. Filtratie, destillatie
en, extractie en chromatografie
We streven naar snelle scheiding en analyse
Scherpe scheiding en nauwkeurige analyse
Aantonen en bepalen micro en ultramicrohoeveelheden
Automatisering
Mengsel verdeelt zich over twee fasen die daarna van elkaar gescheiden worden. De scheiding zal
efficiënter zijn als:
er een evenwichtsinstelling gebeurt
het aantal evenwichtsinstellingen groter is.
Snellere retentietijd zorgt voor meer evenwichten omdat ze beter met elkaar kunnen reageren. Zet dus
niet te veel druk op kolom. Voldoende tijd geven om evenwicht te creeren.
Verdeling coëfficiënt=K = manier waarop een bepaalde component zich verdeeld over 2 fasen.
Men moet overstappen naar fractioneringstechnieken, dus eigenlijk verdeling tussen twee fasen maar
vele malen achter elkaar.
De recovery van de onbekende moet zo volledig mogelijk zijn
P2-3 afleiding kennen
1.2 Extractie
Scheiding op basis van het verschil in oplosbaarheid van de bestanddelen in twee niet mengbare fasen.
Dit gebeurt met organische lagen.
K = [Aorg] / [Awater]
Grotere K dan kruipt stof beter/liever in bovenste laag, organische laag
P4 afleiding kennen
Een extractie zal meer efficiënt verlopen met kleine volumes organische fase ipv met 1 groter volume
Zelf kunnen berekenen, gwn formule toepassen p 4
De stof X is kwantitatief gescheiden als 99% ervan geëxtraheerd is
De verhouding Kx en Ky wordt de scheidingsfactor genoemd. Om in 1 enkele extractie kwantitatief te
scheiden moet Kx ongeveer 10000 maal groter zijn dan Ky
1
,Automatische extractie apparaten werken met het principe van de tegenstroomverdeling of counter
current distribution (CCD)
P7 kennen/kunnen binonium van Newton, grafieken p 8.,9 kunnen maken en berekenen
Hoe groter de K waarde, hoe sneller de component in de bovenfase komt, hoe beter de scheiding
CCD vooral voor nucleïnezuren, eiwitten, vitamine en antibiotica
1.3 Destillatie en HETP
Hoogte equivalent theoretische plaat: hoogte tussen 2 theoretische platen
Meervoudige destillatie is met rectificeerkolom tussen kolf en condensor
Tijdens destillatie is dit oppervlakte om af te koelen en zorgt voor betere scheiding, meer oppervlakte is
beter.
Schotels/platen, op elke schotel gebeurt er een uitwisselingsproces, dus hoe meer hoe beter door meer
uitwisselingsprocessen en beter evenwicht.
Als we de lengte van de kolom delen door het aantal schotels, kleiner getal zijn meer platen, hoe meer
evenwichten.
Bij te lange kolom wordt de totale hoeveelheid vloeistof op de schotels, de ‘hold-up’ aanzienlijk groter.
Dit mag niet meer dan 10% van de te destilleren hoeveelheid bedragen, max 100 schotels.
In chromatografie en ion uitwisseling wordt door het continue verloop, dit evenwicht nooit bereikt. Deze
hebben wel veeeel meer schotels.
Hoe kleiner de HETP, hoe groter het aantal platen per eenheid kolomlengte, dus hoe beter de scheiding.
1.4 Chromatografie
Dit is alles van scheidingstechnieken waar de bestandsdelen zich herhaaldelijk verdelen over 2 fasen.
Ingewikkeld mengsel kan gescheiden worden in zijn verschillende bestanddelen, deze kunnen geïsoleerd
en geïdentificeerd worden. Mengsel wordt aangebracht op een poreuze stationaire fase(blijft in kolom
zitten) en meegenomen door mobiele fase(loopt door kolom).
Mobiele fase loopt over stationaire fase volgens de zwaartekracht (kolomch), pompen(HPLC) of capillaire
werking(papierch).
Verdeling gebeurt op basis van affiniteit voor het eluens en stationaire fase. (scheiding hangt af van hoe
graag ze in elke fase zit) (K = conc stationaire fase / conc mobiele fase)
affiniteit voor eluens wordt bepaald door de oplosbaarheid in eluens of vluchtigheid van component.
affiniteit voor stationaire fase wordt bepaald door adsorpitevermogen van de vase stof of door de
oplosbaarheid als stat vloeistof is.
Stationaire fase vast = adsorptie
stationaire fase vloeistof = verdelingschromatografie
Voordelen:
Zeer specifiek, mengsel met veel comp kan snel gescheiden worden
Groot aanpassingsvermogen, scheiding kan veranderd worden door vers factors, parameters…
voornamelijk temperatuur en eluens veranderen zijn goede aanpassingsfactors
2
, Zeer algemeen karakter
Zeer grote gevoeligheid
K=[Astationaire] / [Amobiele]` hoe groter K hoe langer het duurt voor hij uit kolom komt
K is constant bij een bepaalde temperatuur zolang concentraties van stoffen niet te groot zijn. Lineaire
chromatografie.
Continue toevoegen van mobiele fase geeft dus een continue wisselwerking tussen de twee fasen met
als eindresultaat: scheiding van de bestanddelen over de kolom.
Elutie: het uitwassen van de bestanddelen uit de kolom door het toevoegen van een overmaat nieuw
solvent(eluens)
Chromatogram is detector response ifv tijd (of volume)
Plaats van piek geeft informatie over welk bestandsdeel aanwezig is. De oppervlakte zegt iets over de
concentratie.
Dode tijd, dood volume: tijd dat het solvent nodig heeft om door de kolom te elueren. Iets dat geen
affiniteit vertoont met de stationaire fase. Als stationaire fase polair is dan iets apolair toevoegen om
dode tijd te bepalen.
1.5 Chromatografische parameters
Kolom moet lang genoeg zijn om voldoende scheiding te verkrijgen, maar mag ook niet te lang zijn
omdat er dan zoneverbreding oploopt.
Parameters om efficiënte scheiding te doorgaan
1.5.1 Aantal theoretische platen (N)
Kolom bestaat uit smalle aaneengrenzende lagen(platen) zoals schotels bij destillatie. Op elke plaat
neemt men aan dat er evenwicht plaatsgrijpt van de beschouwde stof tussen stationaire en mobiele
fase. Dit is een opeenvolging van transfers omdat dit continue gebeurt.
Efficiëntie stijgt als aantal evenwichten stijgt dus als aantal platen stijgt.
1.5.2 HETP (H)
Hoeveel platen er voor een bepaalde kolomlengte worden gehaald is interessanter.
N = L/H
L = lengte van kolompakking
H = standaardeviatie2 / L
Efficiëntie wordt groter als H kleiner wordt of N groter wordt
1.5.3 Retentietijd
Hoe groter het verschil in retentietijden hoe beter de scheiding
1.5.4 Resolutie
Pieken moeten zo smal mogelijk zijn, resolutie R = scheidend vermogen
3
