Celbiologie II: regulatiemechanismen
Farmaceutische wetenschappen
Hoofdstuk 1: Sortering van eiwitten
1.1MITOCHONDRIEN
Bevat een dubbele membraan waarvan de permeabiliteit verschilt. Buitenste
bevat veel porien en binnenste veel fosfolipide, cardiolipine, waardoor het
ondoorlaatbaar is.
Hebben eigen DNA dat codeert voor een aantal eiwitten die allemaal
betrokken zijn bij de oxidatieve fosforylatie. Er vinden ook metabole
omzettingen plaats. Stikstofmetabolisme en apoptose worden ook door
mitochondriën geregeld.
Mitochondraal importsysteem
Signaal aan de N terminaal van 20-50 AZ: hydrofobe, positief geladen en
gehydroxyleerde.
Ongevouwen eiwitten worden geimporteerd, maar deze worden eerst
gebonden in het cytosol aan een chaperone. Deze zal vervolgens binden aan
een Tom eiwit (translocon of outer membrane) die het eiwit transfereert naar
een kanaal in het binnenste membraan Tim eiwit (translocon of inner
membrane). Een protease splitst de signaalsequentie af in mitochondriale
matrix. Daarna wordt het eiwit gevouwen (eventueel met chaperonine).
Import vergt energie bij: binding aan chaperone in cytosol, binding aan
chaperonine in matrix en generatie van electrochemische gradient over
binnenste membraan.
Import naar andere compartimenten
- Integratie buitenste membraan: Tom40 eiwit houdt het eiwit tegen en eiwit
beweegt lateraal
- Import in intermembranaire ruimte: eiwit gaat enkel door buitenste membraan
- Import in binnenste membraan: eiwit gaat door buitenste en binnenste
membraan. Naast de signaalsequentie bevat het eiwit een hydrofobe
sequentie waardoor die in het binnenste membraan wordt tegengehouden.
- Import in matrix
1.2PEROXISOMEN (microbodies)
Hebben een enkele membraan, komen voor in alle cellen behalve rode bloedcellen en ze
verschillen in vorm. Ze bevatten oxidase die H2O2 produceren en catalase die het
inactiveert. Ze zijn belangrijk bij de lipidenmetabolisme: β-oxidatie systeem, -oxidatie van
vertakte ketenvetzuren, syntehse van etherfosfolipiden.
Importproces peroxisomale eiwitten
1) Synthese op polyribosomen in het cytosol. 2 soorten signaalsequenties:
• PTS1: C-terminaal, SKL= consensus, wordt niet afgesplitst
• PTS2: N-terminaal, kan afgesplitst worden
2) Cytosolische receptoren herkennen de signaalsequentie en brengen het
naar een eiwit op de peroxisomale membraan.
3) Translocatie door het membraan, afsplitsing peroxisomale matrix eiwit,
recyclage van receptoren naar cytosol.
4) Eiwitten kunnen in gevouwen toestand worden geïmporteerd
5) Alle eiwitten betrokken worden Pex genoemd. Mens heeft er 14.
6) ATP-afhankelijk proces
,1.3TRANSPORT NAAR EN VAN KERN
Membraan bevat veel porien (nuclear pore complexes, NPC) die bestaan uit
een 100 tal verschillende eiwitten, nucleoporines. NPC heeft een octagonale
vorm. In het nucleoplasma worden 8 filamenten samengehouden door een
ring (nuclear basket). Kleine moleculen (<60 kDa) kunnen diffunderen door
een kleine NPC. Grotere eiwitten worden getransporteerd met behulp van
eiwitten die aan nucleoporines binden.
Transport van cytosol naar kern
Eiwitten worden gesynthetiseerd op polyribosomen en bevatten een nuclear
localisatie signaal (NLS) die meestal bestaat uit basische AZ.
NLS-eiwit wordt gebonden door een importin eiwit, deze gaat door het NPC
door te interageren met opeenvolgende nucleoporines. In het nucleoplasma
bindt het importin complex aan Ran-GTP en wordt er een importin – Ran-GTP
complex gevormd. (Ran is een G proteine die ofwel bindt aan GTP of GDP.)
Het complex wordt vervolgens gerecycleerd naar het cytosol. Het GTP wordt
gehydrolyseerd naar GDP door Ran-GAP (GTPase activating protein) en het
importin wordt vrijgezet in het cytosol. Het Ran-GDP wordt dan teruggebracht
naar het nucleoplasma waar een Ran-GEF (guanine nucleotide exchange
factor) het vervangt in GTP.
Transport van kern naar cytosol
Nucleaire exportsignaal (NES) bestaat ofwel uit een leucine rijke sequentie of
iets anders dat niet gedefinieerd is. Het NES eiwit vormt een complex met
een exportin eiwit en het Ran-GTP. Dit complex gaat door de NPC. Het Ran-
GTP wordt aan de cytosolische zijde gehydroliseerd naar Ran-GDP door het
Ran-GAP. Affiniteit voor het exportin eiwit verlaagt waardoor het exportin
wordt vrijgezet. De Ran-GDP en exportin worden gerecycleerd naar de
nucleus. Ran-GDP wordt omgezet in Ran-GTP door Ran-GEF. mRNPs (mRNA
moleculen gebonden aan eiwitten) binden aan een mRNA exporter
proteine om de kern te verlaten.
1.4DE SECRETORISCHE WEG
Oplosbare eiwitten
Synthese start op polyribosomen. N-terminus bevat een signaalsequentie
van 6-30 AZ waarvan 1 of meerdere positief geladen gevolgd door stretch
van 6-12 hydrofobe AZ.
Cotranslationeel import
1) Tijdens de translatie wordt de signaalsequentie gesynthetiseerd
2) De sequentie wordt herkend door Signaal Recognition Particle (SRP), een
ribonucleoproteïne. Translate stopt.
3) Het SRP/signaalsequentie/ribosoom complex bindt aan een SRP
receptor en het ribosoom bindt aan een translocatiekanaal op het ER
membraan.
4) SRP wordt afgesplitst en de eiwitsynthese gaat verder op RER.
5) Terwijl de translatie doorgaat wordt het eiwit getransloceerd naar het
lumen van het ER.
6) Een protease in het ER membraan spitst de signaalsequentie af.
,Insertie van eiwitten in membranen
Integrale membraan proteïnen kunnen opgesplitst worden in 4 categorieën:
- Type I:
N-terminale zijde zit in het lumen, C-terminale kant in cytosol. Interne
hydrofobe sequentie die -helix vormt. Door de hydrofobiciteit kan het
lateraal bewegen. De sequentie wordt ook stop transfer anker sequentie
genoemd.
- Type II en III:
bevatten geen N-terminale signaalsequentie, maar een interne hydrofobe
sequentie die functioneert als signaalsequentie.
Type II: na synthese interne signaalsequentie bindt het complex aan een
translocatiekanaal. De N-zijde is naar het cytosol gericht en de C-zijde
naar het lumen gericht.
Type III: de signaalanker sequentie is dicht bij de N-terminus en bindt aan
het kanaal met de N-terminus naar het lumen gericht en de C-terminus
naar het cytosol.
- Type IV: multipass eiwitten
Bevat meerdere interne signaal-anker sequentie of als stop transfer-anker
sequentie. Insertie is gelijk aan type II of III. Na binding van de eerste -
helix, transloceert de groeiende keten door het kanaal tot het tweede
membraanspannende domein aangemaakt wordt. Deze functioneert als
een stop transfer anker sequentie. Daarna gaat de translatie verder aan
cytosolische zijde tot een derde hydrofobe sequentie gesynthetiseerd
wordt die fungeert als een nieuwe signaal-anker sequentie en de vierde als
een stop-anker sequentie.
GPI verankerde eiwit
Deze worden geïnsereerd zoals de type I. Een enzym in het ER membraan splitst de
hydrofobe signaalsequentie af en transfereert de rest van het eiwit naar een
Glycosylphosphatidylinositol (GPI). Het eiwit zit enkel aan de luminale zijde. Het
voordeel is dat deze meer beweeglijk is in de dubbellaag
Proteine vouwing, modificatie en kwaliteitscontrole in het ER
Modificaties van eiwitten in het ER voor ze hun eindbestemming bereiken zijn:
1) Vouwing en kwaliteitscontrole
2) Vorming van disulfide bruggen
3) N-Glycosylatie
1. Vouwing en kwaliteitscontrole
Na synthese volgt een correcte vouwing van het eiwit, dit wordt gedaan met hulp van
enzymes:
• Chaperone BiP
• Lectines (eiwitten die suikers binden) zoals calnexin en calreticulin:
ze binden aan suikers van het eiwit die in aanmaak zijn zodat er
geen affrefatie van et aangemaakte eind voorkomen wordt
• Protein disulfide isomerase (PDI) bevordert de vouwing met disulfide bruggen
• Peptidyl-prolyl isomerase catalyseert rotatie van de eiwitketen ter
hoogte van prolyl residus
Eiwitten die niet correct gevouwen zijn kunnen het RER niet verlaten en blijven
gebonden aan chaperones. Het ERAD (ER associated degradation) proces zorgt ervoor
dat ze teruggestuurd worden naar het cytosol en afgebroken via de ubiquitine
proteolytische weg in het proteasoom.
, Als het RER te veel ongevouwen eiwitten bevat ontstaat ER stress en wordt het
unfolded protein response (UPR) geactiveerd. Transcriptie van genen die coderen voor
Farmaceutische wetenschappen
Hoofdstuk 1: Sortering van eiwitten
1.1MITOCHONDRIEN
Bevat een dubbele membraan waarvan de permeabiliteit verschilt. Buitenste
bevat veel porien en binnenste veel fosfolipide, cardiolipine, waardoor het
ondoorlaatbaar is.
Hebben eigen DNA dat codeert voor een aantal eiwitten die allemaal
betrokken zijn bij de oxidatieve fosforylatie. Er vinden ook metabole
omzettingen plaats. Stikstofmetabolisme en apoptose worden ook door
mitochondriën geregeld.
Mitochondraal importsysteem
Signaal aan de N terminaal van 20-50 AZ: hydrofobe, positief geladen en
gehydroxyleerde.
Ongevouwen eiwitten worden geimporteerd, maar deze worden eerst
gebonden in het cytosol aan een chaperone. Deze zal vervolgens binden aan
een Tom eiwit (translocon of outer membrane) die het eiwit transfereert naar
een kanaal in het binnenste membraan Tim eiwit (translocon of inner
membrane). Een protease splitst de signaalsequentie af in mitochondriale
matrix. Daarna wordt het eiwit gevouwen (eventueel met chaperonine).
Import vergt energie bij: binding aan chaperone in cytosol, binding aan
chaperonine in matrix en generatie van electrochemische gradient over
binnenste membraan.
Import naar andere compartimenten
- Integratie buitenste membraan: Tom40 eiwit houdt het eiwit tegen en eiwit
beweegt lateraal
- Import in intermembranaire ruimte: eiwit gaat enkel door buitenste membraan
- Import in binnenste membraan: eiwit gaat door buitenste en binnenste
membraan. Naast de signaalsequentie bevat het eiwit een hydrofobe
sequentie waardoor die in het binnenste membraan wordt tegengehouden.
- Import in matrix
1.2PEROXISOMEN (microbodies)
Hebben een enkele membraan, komen voor in alle cellen behalve rode bloedcellen en ze
verschillen in vorm. Ze bevatten oxidase die H2O2 produceren en catalase die het
inactiveert. Ze zijn belangrijk bij de lipidenmetabolisme: β-oxidatie systeem, -oxidatie van
vertakte ketenvetzuren, syntehse van etherfosfolipiden.
Importproces peroxisomale eiwitten
1) Synthese op polyribosomen in het cytosol. 2 soorten signaalsequenties:
• PTS1: C-terminaal, SKL= consensus, wordt niet afgesplitst
• PTS2: N-terminaal, kan afgesplitst worden
2) Cytosolische receptoren herkennen de signaalsequentie en brengen het
naar een eiwit op de peroxisomale membraan.
3) Translocatie door het membraan, afsplitsing peroxisomale matrix eiwit,
recyclage van receptoren naar cytosol.
4) Eiwitten kunnen in gevouwen toestand worden geïmporteerd
5) Alle eiwitten betrokken worden Pex genoemd. Mens heeft er 14.
6) ATP-afhankelijk proces
,1.3TRANSPORT NAAR EN VAN KERN
Membraan bevat veel porien (nuclear pore complexes, NPC) die bestaan uit
een 100 tal verschillende eiwitten, nucleoporines. NPC heeft een octagonale
vorm. In het nucleoplasma worden 8 filamenten samengehouden door een
ring (nuclear basket). Kleine moleculen (<60 kDa) kunnen diffunderen door
een kleine NPC. Grotere eiwitten worden getransporteerd met behulp van
eiwitten die aan nucleoporines binden.
Transport van cytosol naar kern
Eiwitten worden gesynthetiseerd op polyribosomen en bevatten een nuclear
localisatie signaal (NLS) die meestal bestaat uit basische AZ.
NLS-eiwit wordt gebonden door een importin eiwit, deze gaat door het NPC
door te interageren met opeenvolgende nucleoporines. In het nucleoplasma
bindt het importin complex aan Ran-GTP en wordt er een importin – Ran-GTP
complex gevormd. (Ran is een G proteine die ofwel bindt aan GTP of GDP.)
Het complex wordt vervolgens gerecycleerd naar het cytosol. Het GTP wordt
gehydrolyseerd naar GDP door Ran-GAP (GTPase activating protein) en het
importin wordt vrijgezet in het cytosol. Het Ran-GDP wordt dan teruggebracht
naar het nucleoplasma waar een Ran-GEF (guanine nucleotide exchange
factor) het vervangt in GTP.
Transport van kern naar cytosol
Nucleaire exportsignaal (NES) bestaat ofwel uit een leucine rijke sequentie of
iets anders dat niet gedefinieerd is. Het NES eiwit vormt een complex met
een exportin eiwit en het Ran-GTP. Dit complex gaat door de NPC. Het Ran-
GTP wordt aan de cytosolische zijde gehydroliseerd naar Ran-GDP door het
Ran-GAP. Affiniteit voor het exportin eiwit verlaagt waardoor het exportin
wordt vrijgezet. De Ran-GDP en exportin worden gerecycleerd naar de
nucleus. Ran-GDP wordt omgezet in Ran-GTP door Ran-GEF. mRNPs (mRNA
moleculen gebonden aan eiwitten) binden aan een mRNA exporter
proteine om de kern te verlaten.
1.4DE SECRETORISCHE WEG
Oplosbare eiwitten
Synthese start op polyribosomen. N-terminus bevat een signaalsequentie
van 6-30 AZ waarvan 1 of meerdere positief geladen gevolgd door stretch
van 6-12 hydrofobe AZ.
Cotranslationeel import
1) Tijdens de translatie wordt de signaalsequentie gesynthetiseerd
2) De sequentie wordt herkend door Signaal Recognition Particle (SRP), een
ribonucleoproteïne. Translate stopt.
3) Het SRP/signaalsequentie/ribosoom complex bindt aan een SRP
receptor en het ribosoom bindt aan een translocatiekanaal op het ER
membraan.
4) SRP wordt afgesplitst en de eiwitsynthese gaat verder op RER.
5) Terwijl de translatie doorgaat wordt het eiwit getransloceerd naar het
lumen van het ER.
6) Een protease in het ER membraan spitst de signaalsequentie af.
,Insertie van eiwitten in membranen
Integrale membraan proteïnen kunnen opgesplitst worden in 4 categorieën:
- Type I:
N-terminale zijde zit in het lumen, C-terminale kant in cytosol. Interne
hydrofobe sequentie die -helix vormt. Door de hydrofobiciteit kan het
lateraal bewegen. De sequentie wordt ook stop transfer anker sequentie
genoemd.
- Type II en III:
bevatten geen N-terminale signaalsequentie, maar een interne hydrofobe
sequentie die functioneert als signaalsequentie.
Type II: na synthese interne signaalsequentie bindt het complex aan een
translocatiekanaal. De N-zijde is naar het cytosol gericht en de C-zijde
naar het lumen gericht.
Type III: de signaalanker sequentie is dicht bij de N-terminus en bindt aan
het kanaal met de N-terminus naar het lumen gericht en de C-terminus
naar het cytosol.
- Type IV: multipass eiwitten
Bevat meerdere interne signaal-anker sequentie of als stop transfer-anker
sequentie. Insertie is gelijk aan type II of III. Na binding van de eerste -
helix, transloceert de groeiende keten door het kanaal tot het tweede
membraanspannende domein aangemaakt wordt. Deze functioneert als
een stop transfer anker sequentie. Daarna gaat de translatie verder aan
cytosolische zijde tot een derde hydrofobe sequentie gesynthetiseerd
wordt die fungeert als een nieuwe signaal-anker sequentie en de vierde als
een stop-anker sequentie.
GPI verankerde eiwit
Deze worden geïnsereerd zoals de type I. Een enzym in het ER membraan splitst de
hydrofobe signaalsequentie af en transfereert de rest van het eiwit naar een
Glycosylphosphatidylinositol (GPI). Het eiwit zit enkel aan de luminale zijde. Het
voordeel is dat deze meer beweeglijk is in de dubbellaag
Proteine vouwing, modificatie en kwaliteitscontrole in het ER
Modificaties van eiwitten in het ER voor ze hun eindbestemming bereiken zijn:
1) Vouwing en kwaliteitscontrole
2) Vorming van disulfide bruggen
3) N-Glycosylatie
1. Vouwing en kwaliteitscontrole
Na synthese volgt een correcte vouwing van het eiwit, dit wordt gedaan met hulp van
enzymes:
• Chaperone BiP
• Lectines (eiwitten die suikers binden) zoals calnexin en calreticulin:
ze binden aan suikers van het eiwit die in aanmaak zijn zodat er
geen affrefatie van et aangemaakte eind voorkomen wordt
• Protein disulfide isomerase (PDI) bevordert de vouwing met disulfide bruggen
• Peptidyl-prolyl isomerase catalyseert rotatie van de eiwitketen ter
hoogte van prolyl residus
Eiwitten die niet correct gevouwen zijn kunnen het RER niet verlaten en blijven
gebonden aan chaperones. Het ERAD (ER associated degradation) proces zorgt ervoor
dat ze teruggestuurd worden naar het cytosol en afgebroken via de ubiquitine
proteolytische weg in het proteasoom.
, Als het RER te veel ongevouwen eiwitten bevat ontstaat ER stress en wordt het
unfolded protein response (UPR) geactiveerd. Transcriptie van genen die coderen voor
