HC9 Massaspectrometrie en eiwit sequencing
Enzymatische fragmentering, hoe ging dat? “Edman degradatie”
- Openen/knippen van aminozuurketen
- Chemische verandering (reactie) van het eindstandig aminozuur met fenyl-iso-thio-cyanaat
- Losmaken van dit aminozuur (rest blijft intact)
- Bepaling identiteit aminozuur (papierchromatografie)
- Volgend aminozuur
- Hiermee identificatie van gehele eiwit, max 50 aminozuren
- Nu: sequencing DNA. Eiwitsequencing minder belangrijk, en massa spectrometrie op eiwitten en
peptiden
Proteomics
- Studie van structuur, functie en interacties van eiwitten in cel
- Proteomics: eiwit structuur en functie onderzoeken op grote schal
- Onderzoek naar eiwitten in de cel op een bepaald moment onder bepaalde condities
- Identificatie en kwantificering van eiwitten en de bepaling van lokalisatie, activiteit en functie
Eiwit met fosfaatgroep eiwit staat meestal aan, als er geen fosfaatgroep aanwezig is, dan staat het
eiwit uit
Massaspectrometer moderne manier om eiwitsequenties te bepalen
1. Vaste stof of vloeistof gas, dmv ioniseren, beschieten met elektronen waardoor moleculen
lading (+) krijgen en verhitten
2. Positief geladen ionen vliegen door negatief geladen buis
3. Magnetisch veld: schiet ionen uit de baan, hoe groter het positieve ion, hoe langer het duurt
voordat ion op detector terecht komt
4. Detector kan massa ion meten
5 fasen in massa analyse in massa spectrometer
1. Vaporisatie
o Analyse van gassen, vloeistoffen, vaste stoffen
o Verneveling, gasvorming noodzakelijk
2. Ionisatie
o Harde/zachte technieken (ESI/MALDI)
o Electron ionisatie, electronspray ionisatie, schieten van elektronen op eiwitten
o Moleculen in mantel van hydrofobe en hydrofiele stoffen “droplets”
3. Versnelling
o Electroden, aftstoting, aantrekking, meer aantrekking, versnelling
4. Deflectie
o Magnetisch veld minder massa, meer lading, afbuiging
5. Detectie
o Wat eerst komt is: meer beïnvloed door magnetisch veld
o Grote moleculen, weinig lading
,MALDI-Tof
- Eigenschappen en voordelen
o Analyse voor alle eiwitten
o Snel en kleine samples om te analyseren
o Identiteit van alle pieken weten is niet essentieel
o Het gaat om patroon van pieken
Maar wij willen meer informatie tandem massaspectrometrie (MS/MS)
Eiwitten sequencen mbv MS/MS
1. Isolatie eiwit (bandjes uit gel isoleren op juiste molecuulgewicht eiwit)
2. Eiwit in stukjes knippen (peptiden)
o Restrictie-enzymen (specifieke peptidasen) voor eiwitten, knippen bij bepaalde
aminozuurvolgorde
3. Peptiden scheiden
o Met vloeistof chromatografie
4. 1e MS analyse (lage ionisatie)
o Geeft peptide van x aantal aminozuren
5. 2e MS analyse (hoge ionisatie)
o Geeft het x aantal aminozuren
o Enkele en dubbele aminozuren bepalen volgorde aminozuren in peptide
Manieren van analyse
- 1 eiwit top down proteom analyse
o 2D gel elektrophorese (scheiding op lading en grootte)
o Eiwitbandjes van interesse uit gel knippen en knippen in peptiden
o Massaspectormetrie aminozuurvolgorde eiwit
- Alle eiwitten bottom up proteom analyse
o Eiwit-restrictie-enzymen knippen eiwitten in peptides
o Vloeistofchromatografie peptiden worden gescheiden
o Massaspectrometrie elke fractie, geeft informatie over alle eiwitten
1. Cellen lyseren
2. Eiwitten oplossen
3. In sommige gevallen voorscheiding
Overzicht
- Eiwit analyse wordt steeds meer met massa spectrometrie uitgevoerd het levert je “proteom”
informatie op
- Peptiden worden vaak geïdentificeerd in massa spectrometrie
- Grote eiwitten zijn niet direct te analyseren in MS
o Wel met SDS/PAGE of 2D-gels
- Databanken zijn onontbeerlijk om tot identificatie te komen
- NCBI protein, UniprotKB, ExPaSy, Mascot
o Tools/databanken op internet moet je minimaal kennen om met eiwitten te werken
, Fylogenetische analyse zoogdieren (Clustal Omega)
Mitochondriale eiwitten veranderen minder snel dan in de kern gecodeerde eiwitten
- Mitochondriën hebben eigen genoom, je krijgt het van je moeder, kern DNA is van je vader en
moeder
Mitochondriale eiwitten worden gebruikt voor moleculaire identificatie ofwel biodiversiteit bepaling
- Aminozuurverschillen tussen 2 van deze eiwitten is evenredig met het fylogenetische verschil
tussen de soorten
- Je kunt aan de hand van de sequenties een fylogenetische stamboom maken
- Studies aan moleculaire evolutie
Blasten
Sequences met een e-value van 10-4 of lager aangenomen kan worden dat de sequentie homoloog of
gerelateerd is aan de start-sequenties
Enzymatische fragmentering, hoe ging dat? “Edman degradatie”
- Openen/knippen van aminozuurketen
- Chemische verandering (reactie) van het eindstandig aminozuur met fenyl-iso-thio-cyanaat
- Losmaken van dit aminozuur (rest blijft intact)
- Bepaling identiteit aminozuur (papierchromatografie)
- Volgend aminozuur
- Hiermee identificatie van gehele eiwit, max 50 aminozuren
- Nu: sequencing DNA. Eiwitsequencing minder belangrijk, en massa spectrometrie op eiwitten en
peptiden
Proteomics
- Studie van structuur, functie en interacties van eiwitten in cel
- Proteomics: eiwit structuur en functie onderzoeken op grote schal
- Onderzoek naar eiwitten in de cel op een bepaald moment onder bepaalde condities
- Identificatie en kwantificering van eiwitten en de bepaling van lokalisatie, activiteit en functie
Eiwit met fosfaatgroep eiwit staat meestal aan, als er geen fosfaatgroep aanwezig is, dan staat het
eiwit uit
Massaspectrometer moderne manier om eiwitsequenties te bepalen
1. Vaste stof of vloeistof gas, dmv ioniseren, beschieten met elektronen waardoor moleculen
lading (+) krijgen en verhitten
2. Positief geladen ionen vliegen door negatief geladen buis
3. Magnetisch veld: schiet ionen uit de baan, hoe groter het positieve ion, hoe langer het duurt
voordat ion op detector terecht komt
4. Detector kan massa ion meten
5 fasen in massa analyse in massa spectrometer
1. Vaporisatie
o Analyse van gassen, vloeistoffen, vaste stoffen
o Verneveling, gasvorming noodzakelijk
2. Ionisatie
o Harde/zachte technieken (ESI/MALDI)
o Electron ionisatie, electronspray ionisatie, schieten van elektronen op eiwitten
o Moleculen in mantel van hydrofobe en hydrofiele stoffen “droplets”
3. Versnelling
o Electroden, aftstoting, aantrekking, meer aantrekking, versnelling
4. Deflectie
o Magnetisch veld minder massa, meer lading, afbuiging
5. Detectie
o Wat eerst komt is: meer beïnvloed door magnetisch veld
o Grote moleculen, weinig lading
,MALDI-Tof
- Eigenschappen en voordelen
o Analyse voor alle eiwitten
o Snel en kleine samples om te analyseren
o Identiteit van alle pieken weten is niet essentieel
o Het gaat om patroon van pieken
Maar wij willen meer informatie tandem massaspectrometrie (MS/MS)
Eiwitten sequencen mbv MS/MS
1. Isolatie eiwit (bandjes uit gel isoleren op juiste molecuulgewicht eiwit)
2. Eiwit in stukjes knippen (peptiden)
o Restrictie-enzymen (specifieke peptidasen) voor eiwitten, knippen bij bepaalde
aminozuurvolgorde
3. Peptiden scheiden
o Met vloeistof chromatografie
4. 1e MS analyse (lage ionisatie)
o Geeft peptide van x aantal aminozuren
5. 2e MS analyse (hoge ionisatie)
o Geeft het x aantal aminozuren
o Enkele en dubbele aminozuren bepalen volgorde aminozuren in peptide
Manieren van analyse
- 1 eiwit top down proteom analyse
o 2D gel elektrophorese (scheiding op lading en grootte)
o Eiwitbandjes van interesse uit gel knippen en knippen in peptiden
o Massaspectormetrie aminozuurvolgorde eiwit
- Alle eiwitten bottom up proteom analyse
o Eiwit-restrictie-enzymen knippen eiwitten in peptides
o Vloeistofchromatografie peptiden worden gescheiden
o Massaspectrometrie elke fractie, geeft informatie over alle eiwitten
1. Cellen lyseren
2. Eiwitten oplossen
3. In sommige gevallen voorscheiding
Overzicht
- Eiwit analyse wordt steeds meer met massa spectrometrie uitgevoerd het levert je “proteom”
informatie op
- Peptiden worden vaak geïdentificeerd in massa spectrometrie
- Grote eiwitten zijn niet direct te analyseren in MS
o Wel met SDS/PAGE of 2D-gels
- Databanken zijn onontbeerlijk om tot identificatie te komen
- NCBI protein, UniprotKB, ExPaSy, Mascot
o Tools/databanken op internet moet je minimaal kennen om met eiwitten te werken
, Fylogenetische analyse zoogdieren (Clustal Omega)
Mitochondriale eiwitten veranderen minder snel dan in de kern gecodeerde eiwitten
- Mitochondriën hebben eigen genoom, je krijgt het van je moeder, kern DNA is van je vader en
moeder
Mitochondriale eiwitten worden gebruikt voor moleculaire identificatie ofwel biodiversiteit bepaling
- Aminozuurverschillen tussen 2 van deze eiwitten is evenredig met het fylogenetische verschil
tussen de soorten
- Je kunt aan de hand van de sequenties een fylogenetische stamboom maken
- Studies aan moleculaire evolutie
Blasten
Sequences met een e-value van 10-4 of lager aangenomen kan worden dat de sequentie homoloog of
gerelateerd is aan de start-sequenties
